نمودار ۴-۳- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور رقت ۶۴
نمودار ۴-۴- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور شوری (درصد) ۷۲
نمودار ۴-۵- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور زمان شمارش کلنی‏ها (روز) تحت تنش شوری ۷۲
نمودار ۴-۶- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور رقت تحت تنش شوری ۷۳
نمودار ۴-۷- تاثیر سطوح مختلف خشکی و ماده حامل بر بقاء باکتری در فرمول ۷۶
نمودار ۴-۸- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور pH 83
نمودار۴ -۹- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور زمان شمارش کلنی‏ها (روز) تحت تنش pH 83
نمودار ۴-۱۰- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور رقت تحت تنش pH 84
نمودار ۴-۱۱- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور زمان شمارش کلنی‏ها (دقیقه) تحت تنش uv 88
نمودار ۴-۱۲- تاثیر مواد حامل بر بقاء باکتری بر اساس فاکتور رقت تحت تنش uv 89
نمودار ۴-۱۴- بقا باکتری در سطوح مختلف تلقیح ۹۵
نمودار ۴-۱۵- اندازه طول برگ در تیمارها ۹۹
نمودار ۴-۱۶- وزن خشک گیاه در تیمارها ۱۰۰
نمودار ۴-۱۷- وزن تر گیاه در تیمارها ۱۰۰
نمودار ۴-۱۸- آنالیز فسفات خاک گلدان ها در تیمارها ۱۰۱
نمودار ۴-۱۹- آنالیز فسفات گیاه در تیمارها ۱۰۱
نمودار ۴-۲۱- بقا باکتری در حامل‏ و رقت‏های مختلف در مدت ۹۰ روز ۱۰۸
نمودار ۴-۲۲- بقا باکتری در حامل‏های مختلف در مدت ۹۰ روز ۱۰۹
نمودار ۴-۲۳- بقا باکتری درمدت زمان ۹۰ روز‏ و رقت‏های مختلف ۱۰۹
فهرست شکل ها
عنوان شماره صفحه
شکل ۱-۱- تغییر و تبدیلات فسفر خاک توسط باکتری ها ۱۱
شکل ۱-۲- مکانیسم های انحلال فسفات توسط باکتری ۱۴
شکل ۱-۳- تاثیر باکتری های حل کننده فسفات روی گیاهان ۱۶
شکل ۱-۴- لیگنیت ۳۰
شکل ۱-۵- گیاه تربچه ۳۱
شکل ۱-۶- تربچه نقلی یا چهار فصل ۳۴
شکل ۳-۱- تیمارهای فرموله شده از لیگنیت، سویا، خاک فسفات ۴۴
شکل ۴-۱- کشت تازه از سویه روی محیط pvk 54
شکل ۴-۲-کشت روی محیط pvk 54
شکل ۴-۳- مقایسه ظاهری تیمار فرمول با کنترل ۹۰
شکل ۴-۴- تیمارهای بکارگرفته شده در گلدان ها در هفته اول و دوم ۱۰۲
شکل ۴-۵- مقایسه ظاهری تیمارها با کنترل ۱۰۲
چکیده
مصرف بی رویه کودهای شیمیایی موجب عدم تعادل عناصر و مواد غذایی موجود در خاک، کاهش بازده محصولات کشاورزی و به خطر افتادن سلامت انسانها و دیگر موجودات زنده شده است. به همین علت امروزه استفاده از کودهای زیستی مورد توجه قرار گرفته است. باکتریهای حل کننده فسفات برای افزایش فراهمی فسفر مورد نیاز گیاه کارآمد به نظر می رسند. با توجه به اینکه اغلب خاک های ایران آهکی بوده و در اقلیم‏های خشک و نیمه خشک هستند، وجود pH بالا، درصد زیاد کربنات کلسیم، کمبود مواد آلی و خشکی خاک باعث شده اند که جذب فسفر کمتر از مقدار لازم برای تامین رشد بهینه اغلب محصولات کشاورزی باشد، لذا هدف از این پژوهش بررسی تاثیر spp. Streptomyces جدا شده از خاک بر انحلال فسفات به منظور تولید کود زیستی فسفاته می باشد. جهت حداکثر افزایش بقاء باکتری در ماده حامل از سطوح تلقیح مختلفی که شامل لیگنیت و مواد تکمیلی پودر سویا و خاک فسفاته با نسبتهای مشخص بود استفاده شد و این مواد حامل تلقیح شده تحت تنشهای دما، شوری، خشکی، pH و uv قرار گرفتند همچنین کلیه مواد حامل ساخته و تلقیح شده بطور جداگانه در یک بازه زمانی ۹۰ روز از لحاظ بررسی بقاء باکتری سنجیده شدند. بهترین فرمول به دست آمده از تنشها در گلدان به کارگیری شد. همچنین تیمارهای دیگری نیز از لیگنیت با سطوح مختلف ساخته و با باکتری و بذر تربچه تلقیح شد و بقاء باکتری در بازه ۲۴ ساعته اندازه گیری شد و بعد از آن در گلدان به کار گرفته شدند. با توجه به نتایج به دست آمده بهترین فرمول به دست آمده از تنشها و بازه زمانی ۹۰ روز، فرمول لیگنیت + خاک فسفات ۲% + سویا ۱% تعیین شد و بعد از بکارگیری در گلدان بهترین نتیجه را نسبت به سایر مواد حامل و کنترل نشان داد و پارامترهای رشد گیاه تربچه و جذب فسفات گیاه را بهتر از تمامی مواد حامل و کنترل افزایش داده است. از بین تیمارهای ساخته شده و تلقیح شده به بذر تیمار شامل ۲۰۰ گرم حامل + خاک مزرعه بهترین نتایج را نشان داد و بعد از به کارگیری تیمارها در گلدان نیز تیمار شامل ۲۰۰ گرم حامل + خاک مزرعه بهترین نتیجه را نشان داد. این فرمول بهترین نتیجه را در پارامترهای رشد گیاه تربچه و جذب فسفات گیاه نسبت به سایر تیمارها نشان داد. در یک نتیجه گیری کلی، فرمول لیگنیت + خاک فسفات ۲% + سویا ۱% به عنوان فرمول نهایی و اصلی برای به کارگیری در آزمایشات بعدی و مقیاس مزرعه پیشنهاد می‏گردد.

کلید واژگان: باکتری‏های حل کننده فسفات،spp. Streptomyces ، کود زیستی فسفاته، لیگنیت، پودر سویا، گیاه تربچه
فصل اول:
کلیات تحقیق
۱-۱- مقدمه
طی چند دهه اخیر به علت افزایش جمعیت و تقاضای روزافزون برای مواد غذایی، مصرف کود های شیمیایی به منظور افزایش مقدار تولید در واحد سطح به شدت افزایش یافته است. استفاده از کودهای شیمیایی فسفاته تاریخچه دیرینه ای دارد و به انقلاب سبز و معرفی کودهای شیمیایی بر می گردد(ساریخانی و همکاران ۱۳۸۹، ۱۳).‏‏‏ مصرف بی رویه کودهای شیمیایی موجب عدم تعادل عناصر و مواد غذایی موجود در خاک، کاهش بازده محصولات کشاورزی و به خطر افتادن سلامت انسان ها و دیگر موجودات زنده خواهد شد. نیاز به جایگزینی مناسب برای کودهای شیمیایی زمانی احساس می شود که بدانیم علاوه بر آسیب های زیست محیطی ناشی از کاربرد کودهای شیمیایی، محدود بودن منابع، افزایش قیمت تمام شده و تثبیت شدن قسمت اعظمی از کودهای فسفاته مصرفی به شکل غیرقابل استفاده برای گیاه نیز پیامدهای استفاده از این کودهای شیمیایی هستند(ساریخانی و همکاران ۱۳۸۹، ۱۳).
ضرورت یافتن جایگزینی مناسب برای رهاسازی فسفات تجمع یافته در خاک زمانی بیشتر احساس می شود که بر این امر واقف گردیم که منابع فسفات موجود در خاک قابلیت تامین فسفات مورد نیاز گیاهان برای تولید بهینه تا صد سال را دارا می باشد. بنابراین کافی است که این منبع عظیم فسفر را به صورت قابل جذب و استفاده برای گیاه تبدیل نمود (Bashan 1998, 16). به همین علت امروزه استفاده از کودهای بیولوژیک مورد توجه قرار گرفته است که مکانیسم عمل آنها قابلیت جذب عناصر غذایی گیاه در خاک را افزایش می‏دهد. باکتریهای حل کننده فسفات برای افزایش فراهمی فسفر مورد نیاز گیاه کارآمد به نظر می رسند (Bashan 1998, 16). فسفر در خاک‌ها به دو شکل آلی و معدنی وجود دارد اما غلظت فسفات محلول در خاک معمولاً خیلی پایین است (Bashan 1998, 16). قسمت اعظم میکرو ‏‏ارگانیسم‏های محلول کننده فسفات در ریزوسفر گیاهان متمرکز شده‌اند. میکروب‏های خاک توانایی تبدیل اشکال نامحلول فسفر به اشکال محلول را دارند. ترکیبات آلی و معدنی خارج شده از ریشه، باعث افزایش جمعیت میکروبی در اطراف ریشه می‌گردند . با توجه به اینکه میکروارگانیسم‏های محلول کننده فسفات در خاک به طور طبیعی وجود دارند و موجب افزایش فسفر قابل دسترس و تحریک رشد گیاه می‌شوند، اما تعداد آن‌ها در خاک به اندازه کافی نیست تا با سایر میکروارگانیسم‏هایی که در ریزوسفر قرار دارند رقابت کنند. بنابراین تلقیح گیاهان با میکروارگانیسم‏های محلول کننده فسفات اثرات مفیدی دارد. باکتریهای حل کننده فسفات طی سه مکانیسم تولید اسیدهای آلی، کلات کردن و واکنش های تبادل لیگاند موجب انحلال ترکیبات نامحلول فسفات می‏شوند. طی فرایند انحلال بخشی از فسفر محلول، توسط باکتری حل کننده فسفات استفاده می‏شود اما از آنجائیکه مقدار فسفر حل شده بیش از نیاز باکتری‏ها است لذا این مقدار آزاد می‏تواند در اختیار گیاه قرار گیرد. اغلب خاک‏های ایران دارای آهک و گچ بوده و این امر می‏تواند موجب تثبیت فسفر شود. در نتیجه فسفر جذب ذرات کلوئیدی خاک شده و از دسترس گیاه خارج می شود. بنابراین در غالب خاک‌ها از نظر مقدار فسفر کل مشکل وجود ندارد، بلکه مشکل، در دسترس قرار گرفتن آن می‌باشد. فسفر جذب عناصری مانند Ca²⁺، Fe³⁺ و Al³⁺ شده و باعث تشکیل ترکیبات نامحلول می‌گردد (Bhattacharyya and Jha 2012, 28).
^[۱]PGPR یا باکتری های تحریک کننده رشد گیاه، گروهی از باکتری‏های ریزوسفر هستند که به طور مستقیم (انحلال فسفات، تولید هورمونها…) و غیر مستقیم (تولید کاتالاز، سیانید هیدروژن و….) موجب افزایش رشد گیاه می شوند. با توجه به طیف گسترده اثرات مثبت برخی از باکتریهای سودمند از قبیل تولید سیدروفور، تولید هورمونها و ویژگی بیوکنترلی آنها بر ضد قارچها و عوامل بیماریزا، متمرکز شدن بر تحقیقاتی که منجر به حصول چنین میکروارگانیسم های چند منظوره ای باشد بسیار مثمر ثمر خواهد بود، زیرا کودهای زیستی تلقیحات میکروبی هستند که علاوه بر افزایش جذب عناصر غذایی، موجب افزایش رشد گیاه می‏شوند، بنابراین با کاربرد سویه های PGPR می‏توان چندین هدف را به طور همزمان دنبال کرد ((Boraste 2009, 1; Saharan and Nehra 2011, 21.
استفاده از ماده حامل مناسب در تولید یک کود زیستی با کیفیت بسیار مهم و ضروری است. ذغالسنگ نارس^[۲]، ذغالسنگ قهوهای^[۳]، چارکل^[۴]، گل یا لجن فشرده، کودهای مزرعهای و مخلوط خاکها میتوانند به عنوان یک حامل مناسب استفاده شوند. ذغال سنگ طبیعی و ذغال سنگ قهوه ای حاملهای بهتری برای کودهای زیستی هستند. الحاق میکروارگانیسم به ماده حامل باید به گونه ای باشد که قابل حمل و لمس راحت و تجزیه طولانی باشد و کمترین اثر را روی کود زیستی بگذارد. بر طبق تحقیقات هوبن^[۵] و سوماسه گاران^[۶] یک ماده حامل خوب برای تلقیح بذر، باید ارزان و به راحتی در دسترس باشد، علاوه بر این نباید برای سویه های باکتریایی و گیاه سمی باشد زیرا حامل می تواند روی بذر اثر بگذارد. همچنین حامل باید ظرفیت جذب رطوبت خوبی داشته باشد و به خوبی به بذر متصل شود و در نهایت حامل باید ظرفیت بافری و pH مناسبی داشته باشد و به راحتی بتوان آن را با اشعه گاما یا اتوکلاو استریلیزه کرد (Boraste 2009, 1).
باتوجه به اینکه در خاک های آهکی ایران که در اقلیم های خشک و نیمه خشک تحول پیدا کرده اند، وجود pH بالا، درصد زیاد کربنات کلسیم، کمی مواد آلی و خشکی خاک باعث شده اند که جذب فسفر کمتر از مقدار لازم برای تامین رشد بهینه اکثر محصولات کشاورزی باشد. لذا هدف از این پژوهش بررسی تاثیر spp. Streptomyces جدا شده از خاک بر انحلال فسفات به منظور تولید کود زیستی فسفاته می باشد.
۱-۲- روابط میکروارگانیسم با ریشه گیاهان
میکروارگانیسم های خاک ارتباط های گسترده و متنوعی با ریشه گیاهان عالی دارند که مهمترین آنها عبارتند از:

1. 1. همزیستی: به شکل ارتباط های میکوریزی و تشکیل گرهک در گیاهان خانواده لگومینوز میباشد.

1. 1. انگلی: دراین حالت ارگانیسمهای انگل به صورت غیراختصاصی تا بسیار اختصاصی عمل می کنند.

1. 1. روابط تقریباً نامشخص که در ریزوسفر و سطح ریشه گیاه وجود دارد.