۴-۴- بررسی تغییرات پارامترهای رنگی کمپلکس دی‌کرومات ـ دی فنیل کربازید
به منظور بررسی تغییرات پارامترهای رنگی کمپلکس ایجاد شده بین دی‌کرومات و دی فنیل کربازید، فیلم‌های تهیه شده (با شرایط mL 25 کلروفرم حاوی g DPC01/0)، برای مدت زمان ۶۰ دقیقه در محلول دی‌کرومات پتاسیم با غلظتهای مختلف قرار داده شد، پس از شویش و خشک شدن فیلم‌ها، اسکن انجام گرفت. تغییرات پارامترهای رنگی در شکل ۴-۲ نمایش داده شده است.

شکل ۴-۲- تغییرات پارامترهای رنگی قرمز، سبز و آبی در کمپلکس ایجاد شده بین دی‌کرومات و دی فنیل کربازید، (شرایط: حجم دی‌کرومات، mL10، حجم کلروفرم برای ساخت فیلم mL25، مقدار دی فنیل کربازید برای ساخت فیلم g01/0، مدت زمان تماس فیلم با محلول دی‌کرومات، ۶۰ دقیقه، میله‌های خطا برای ۵ نمونه‌برداری می‌باشد.)
با توجه به داده‌های شکل ۴-۲، با افزایش غلظت دی‌کرومات در محلول، مقدار هر سه پارامتر رنگی کاهش می‌یابد. بنابراین کاهش هر کدام از سه پارامتر رنگی به معنای افزایش شدت رنگ کمپلکس ایجاد شده می‌باشد.
۴-۵- تأثیر pH روی تشکیل کمپلکس بین دی‌کرومات و DPC
به منظور بررسی تأثیر pH روی کمپلکس ایجاد شده بین دی‌کرومات و دی فینل کربازید، فیلم های تهیه شده (با شرایط ۲۵ mL کلروفرم حاوی ۰۱/۰ گرم DPC )، به مدت ۶۰ دقیقه در محلول حای دی‌کرومات با غلظت ppm20، در pH‌های مختلف از ۱۲-۱ قرار داده شد. پارامترهای رنگی فیلمها پس از شویش با آب و اسکن، استخراج شد. شکل ۴-۴ این تغییرات را نشان می‌دهد.
شکل ۴-۳- نمودار تغییرات گونه‌های کروم ]۷۰[.
شکل ۴-۴- تأثیر pH روی پارامترهای رنگی کمپلکس ایجاد شده در بستر فیلم بین دی‌کرومات و دی فنیل کربازید (شرایط: دی‌کرومات ppm20، حجم دی‌کرومات، mL10، حجم کلروفرم برای ساخت فیلم mL25، مقدار دی فنیل کربازید برای ساخت فیلم g 01/0، مدت زمان تماس فیلم با محلول بافر، ۶۰ دقیقه، میله‌های خطا برای ۵ نمونه‌برداری می‌باشد.)
شکل ۴-۳ تغییرات گونه‌های مختلف کروم را برحسب pH نشان می‌دهد، در pHهای محدوده ۶- ۷، گونه دی‌کرومات به تدریج به کرومات تبدیل می‌شود.
با توجه به شکل ۴-۴، در نواحی pH معادل ۸- ۵ تغییرات هر سه پارامتر رنگی کم بوده و به مقدار کمینه خود رسیده است. در ۶=pH، هر سه پارامتر به طور همزمان در کمترین مقدار خود قرار دارند، به عبارتی دیگر در این pH، کمپلکس دارای بیشترین رنگ می‌باشد. بنابراین همین مقدار به عنوان pH بهینه برای اندازه‌گیری‌های بعدی استفاده خواهد شد.
۴-۶- بهینه‌سازی غلظت DPC برای تهیه فیلم
به منظور به دست آوردن غلظت بهینه دی‌ فنیل‌کربازید برای تهیه فیلم حسگر، فیلم‌هایی با غلظتهای مختلف از دی فنیل کربازید ساخته شد. غلظت دی فنیل‌کاربازید به صورت میزان گرم این ماده در mL25 کلروفرم گزارش شده است. سپس فیلمها به مدت ۶۰ دقیقه در تماس با محلول دی‌کرومات ppm20 با pH بهینه (pH معادل۶) قرار داده شد. پس از شویش و خشک شدن فیلمها، اسکن انجام گرفت و پارامترهای رنگی به دست آمد. این پارامترها در شکل ۴-۵ ترسیم شده است.
شکل ۴-۵- تأثیر غلظت دی فنیل‌کربازید روی پارامترهای رنگی کمپلکس ایجاد شده در بستر فیلم (شرایط: دی کرومات ۲۰ ppm، حجم دی‌کرومات،ml 10، حجم کلروفرم برای ساخت فیلم mL25، مدت زمان تماس فیلم با محلول بافر، ۶۰ دقیقه، میله های خطا برای ۵ نمونه‌برداری می‌باشد.)
با توجه به داده‌های شکل ۴-۵، با افزایش غلظت دی فنیل‌کربازید، با توجه به کاهش مقدار پارامترهای رنگی، میزان تشکیل کمپلکس و شدت رنگ آن افزایش می‌یابد. از غلظت g01/0 به ازای mL25 کلروفرم به بالاتر، مقدار پارامترهای رنگی تقریباً ثابت باقی می ماند، بنابراین غلظت g 01/0 به ازای mL15کلروفرم به عنوان غلظت بهینه دی فنیل‌کربازید در نظر گرفته می‌شود.
۴-۷- بررسی تأثیر زمان تماس فیلم حسگر با محلول دی‌کرومات (زمان پاسخگویی)
به منظور بررسی تأثیر میزان تماس فیلم حسگر با محلول دی‌کرومات، تعدادی فیلم آغشته به دی فنیل‌کربازید در شرایط بهینه (شامل ۰۱/۰گرم دی فنیل کربازید در mL25 کلروفرم) تهیه شد. سپس فیلم‌ها با مدت زمان‌های طولانی در تماس با محلول دی‌کرومات با غلظت ppm20 تماس داده شد. فیلم‌ها پس از شویش و خشک شدن اسکن شد. داده‌های مربوط به آنالیز تصاویر در شکل ۴-۶ ارائه شده است.
شکل ۴-۶- تأثیر زمان تماس فیلم حسگر با محلول دی‌کرومات (شرایط: غلظت دی‌کرومات، ppm20، حجم دی‌کرومات، mL 10، غلظت دی فنیل کاربازید برای تهیه فیلم: ۰۱/۰ گرم، حجم کلروفرم برای تهیه فیلم: mL 25، pH محلول دی‌کرومات، ۶، میله‌های خطا برای ۵ بار نمونه برداری گزارش شده است.)
با توجه به داده‌های شکل ۴-۶، مقدار پارامترهای رنگی تا مدت زمان ۲۰ دقیقه کاهش یافته (یعنی شدت رنگ کمپلکس افزایش می‌یابد.) پس از ۲۰ دقیقه، شدت رنگ ثابت باقی می‌ماند. بنابراین مدت زمان ۲۰ دقیقه به عنوان زمان بهینه آزمایش در نظر گرفته می‌شود.
۴-۸- بررسی ماندگاری فیلم حسگر
به منظور بررسی ماندگاری فیلم حسگر، تعدادی فیلم در شرایط بهینه تهیه شده (حجم mL25 کلروفرم حاوی g 01/0 دی فنیل کاربازید) تهیه شد. بلافاصله فیلمها در سه شرایط مختلف شامل هوای اتاق، آب مقطر و بافر فسفاتی ۷pH = در مدت زمان‌های مختلف نگه داشته شد. در بازه‌های زمانی مشخص یک فیلم از هر مجموعه برداشته شد و برای مدت زمان بهینه ۲۰ دقیقه با ۱۰ میلی لیتر محلول دی‌کرومات با غلظت ppm20 و ۶pH = روبرو شد. تمام نتایج به دست آمده با نتیجه به دست آمده از فیلم تازه مقایسه شد، و اختلاف پارامتر رنگی در هر مورد محاسبه شد. نتایج مربوط به آنالیز رنگ فیلم‌ها در شکلهای ۴- ۷ تا ۴- ۹ نشان داده شده است.
شکل ۴-۷- تأثیر شرایط نگهداری فیلم در هوای اتاق، روی میزان پاسخگویی (شرایط: غلظت دی‌کرومات،ppm 20، حجم دی کرومات، ml 10، غلظت دی فنیل کاربازید برای تهیه فیلم:g 01/0، حجم کلروفرم برای تهیه فیلم: mL25، pH محلول دی کرومات، ۶، میله‌های خطا برای ۵ بار نمونه‌برداری گزارش شده است).
با توجه به شکل ۴-۷، نگهداری فیلم در هوای اتاق، به تدریج فیلم را تخریب می‌کند. در این شرایط تا مدت زمان ۱۸۰ دقیقه، حداکثر اختلاف در پاسخگویی فیلم نسبت به فیلم تازه تهیه شده به حدود ۲۰ واحد برای پارامتر قرمز به ۱۵ برای دو رنگ سبز و آبی می رسد. همچنین تا مدت زمان ۳۰ دقیقه تغییرات بسیار ناچیز می‌باشد.
شکل ۴-۸- تأثیر شرایط نگهداری فیلم در آب مقطر، روی میزان پاسخگویی (شرایط: غلظت دی‌کرومات، ppm20، حجم دی‌کرومات، mL10، غلظت دی فنیل‌کاربازید برای تهیه فیلم: ۰۱/۰ گرم، حجم کلروفرم برای تهیه فیلم: mL 25، pH محلول دی‌کرومات، ۶، میله های خطا برای ۵ بار نمونه‌برداری گزارش شده است.)
با توجه به داده‌های شکل ۴-۸، فیلم‌های نگهداری شده در آب مقطر از دقیقه ۱۰ به بعد کاهش در حساسیت را نشان می‌دهند. از دقیقه ۲۰ به بعد، حساسیت فیلم‌های نگهداری شده در آب مقطر به کمترین مقدار خود می‌رسد.
شکل ۴-۹- تأثیر شرایط نگهداری فیلم در بافر فسفاتی ۷pH = ، روی میزان پاسخگویی (شرایط: غلظت دی‌کرومات، ۲۰ ppm، حجم دی‌کرومات، mL10 ، غلظت دی فنیل‌کاربازید برای تهیه فیلم: ۰۱/۰ گرم، حجم کلروفرم برای تهیه فیلم: ml25، pH محلول دی‌کرومات، ۶، میله های خطا برای ۵ بار نمونه‌برداری گزارش شده است.)
با توجه به داده‌های شکل ۴-۹، برخلاف دو حالت هوای اتاق و آب مقطر، نگهداری فیلم‌ها در بافر فسفاتی ۷، باعث پایداری فیلم‌ها شده و تا مدت زمان ۱۸۰ دقیقه تغییر محسوسی در حساسیت فیلم مشاهده نمی‌شود. بنابراین اگر نیاز است فیلمهای تهیه شده برای مدت طولانی قبل از انجام سنجش نگهداری شود، باید آن را در بافر فسفاتی با ۷pH = نگهداری نمود.
۴-۹- منحنی کالیبراسیون، ناحیه خطی، حد تشخیص و تکرار‌پذیری
تحت شرایط بهینه به دست آمده، فیلم‌های تهیه شده تحت اثر محلول دی‌کرومات با غلظتهای مختلف قرار گرفت و پارامترهای رنگی استخراج شد. نتایج به عنوان منحنی کالیبراسیون در شکل ۴-۱۰ نمایش داده شده است.
شکل ۴-۱۰- منحنی کالیبراسیون (شرایط: حجم دی‌کرومات، ml10، غلظت دی فنیل کاربازید برای تهیه فیلم: ۱/۰ گرم ،حجم کلروفرم برای تهیه فیلم: mL25، pH محلول دی‌کرومات، ۶، میله های خطا برای ۵ بار نمونه‌برداری گزارش شده است.) معادله خطوط و میزان خطی‌بودن در کنار هر خط نوشته شده است.
با توجه به نمودار کالیبراسیون در شکل ۴-۱۰، هر سه پارامتر رنگی، دامنه خطی معادل ppm 50 – ۵/۰ دی‌کرومات را نشان می‌دهند. حساسیت و میزان خطی‌بودن دو پارامتر قرمز و آبی چندان مطلوب نیست. اما پارامتر سبز هم حساسیت (شیب) مناسب و هم میزان خطی بودن خوبی را در ناحیه خطی از خود نشان می‌دهد.
میزان تکرار‌پذیری برای هر غلظت (برای ۵ بار اندازه‌گیری تکراری) نمایش داده شده است. برای تمام غلظتها در دامنه خطی، میزان انحراف استاندارد نسبی کمتر از ۵% می‌باشد.
همچنین به منظور محاسبه حد تشخیص، تعدادی فیلم شاهد (فیلمی که تازه در شرایط بهینه تهیه شده و تماسی با محلول دی‌کرومات نداشته است) تهیه شد. در نقاط مختلف این فیلمها پس از اسکن، باکسهای نمونه‌برداری قرار داده شد و انحراف استاندارد بلانک برای هر پارامتر رنگی محاسبه گردید. سپس از رابطه LOD = 3SD_Blank/m استفاده شد و میزان حد تشخیص برای پارامتر رنگی سبز معادل ppm 2/0 به دست آمد.
۴-۱۰- بررسی حضور مزاحمت‌ها
به منظور بررسی تأثیر گونه‌های مزاحم، تعدادی فیلم در شرایط بهینه تهیه شد. از طرفی دو سری محلول تهیه شد. در سری اول غلظت دی‌کرومات معادل ppm1/0 بود. سری دوم محلول‌ها حاوی ppm 1/0 از دی‌کرومات و غلظت ۱۰۰ برابر یعنی ۱۰ ppm از یون‌های مزاحم بود. سنجش با هر دو محلول انجام شد و خطا در مورد هر مزاحم محاسبه گردید. نتایج در جدول ۴-۱ نمایش داده شده است. با توجه به داده‌های این جدول خطا در هر سه پارامتر رنگی کمتر از ۱۰ درصد می‌باشد.
جدول ۴-۱- میزان خطای نسبی در روش ارائه شده، غلظت دی کرومات ppm1/0 و غلظت یون مزاحم ۱۰۰ برابر بیشتر