اما به هر حال سیستمهای بسته برون تنی هم محدودیت های خاص خود را دارند. تمامی سیستمهای آزمایشگاهی شکمبه سعی می کنند به نحوی شرایط واقعی شکمبه را تاحد امکان از نظر مواردی چون جمعیت پویا و زنده میکروبی، ورودی و خروجی صحیح مواد مغذی، ثابت ماندن اسیدیته ودما و همچنین مخلوط شدن مداوم شبیه سازی نمایند. اما در هر حال این موارد مشخصه شکمبه به طور کامل درسیستم های برون تنی قابل شبیه سازی نمی باشد. شاید مهمترین محدودیت هر سیستم برون تنی شکمبه درقیاس باشرایط درون تنی، عدم توانایی در شبیه سازی جمعیت میکروبی از نظرتنوع و بقا باشد. تمام سیستم های آزمایشگاهی شکمبه، از تزریق مواد شکمبه ای (مانند شیرابه شکمبه) استفاده می نمایند که می توان گفت که حداقل در مراحل اولیه انکوباسیون، جمعیت میکروبی سیستم مشابه با شکمبه طبیعی می باشد. به هر حال به دلیل ماهیت ذاتی سیستمهای آزمایشگاهی، در این سیستم های جمیت اصلی میکروبی دستخوش تغییرشده و تک یاخته ها ناپدید می شوند (Slyter and Putnam, 1967:Mansfield et al.,1995). که مهمترین دلیل بر تفاوت در فراسنجه ها و الگوی تخمیر در این سیستم در مقایسه با سیستم های زیستی می باشد. به عنوان مثال سیستم های آزمایشگاهی در قیاس با سیستم های بیولوژیکی، قادر نیستند نرخ تجزیه الیاف را برآورد نمایند (Mansfield et al., ۱۹۹۵). باکتری ها (مانند استرپتوکوکوس بوویس) در سیستم بیولوژیک از نظر تعداد کم هستند ولی در شرایط برون تنی ممکن است تکثیر یافته و منجر به تجمع اسید لاکتیک شوند. متاسفانه غلظت اسید لاکتیک و نیز تعداد باکتریهای تولید کننده لاکتات به ندرت در گزارش ها دیده می شود. اسلایتر و پونت نام (۱۹۶۷) به عنوان مثال در شرایط درون تنی هیچ باکتری استرپتوکوکوس بوویس را مشاهده نکردند اما همین باکتری ها در روزهای خاصی از آزمایش در محیط آزمایشگاه ۲ الی ۹ درصد جمعیت باکتری های مورد مطالعه را تشکیل دادند. مانسفیلد و همکاران (۱۹۹۵) در مورد گونه های تجزیه کننده آمیلوز یک افزایش (از ۳/۳ تا ۲/۲۸ درصد) بزرگی را در محیط های آزمایشگاهی نسبت به محیط های بیولوژیک گزارش کردند در حالی که همزمان سهم باکتری های تجزیه کننده سلولز از ۴/۵ درصد درمحیط بیولوژیک به ۷/۱ درصد در محیطهای آزمایشگاهی کاهش یافت. در تمامی مطالعات تک یاخته از نظر تعداد در محیط های آزمایشگاهی به شدت کمتر از محیط های بیولوژیکی بودند.
در تمامی موارد اغلب این سوال اساسی پیش می آید که کدام سیستم آزمایشگاهی برای مطالعه اثرات ترکیبات فعال زیستی مختلف (مانند اسانس های گیاهی) بر شکمبه مناسب است. هر دو سیستم آزمایشگاهی مطالعات شکمبه ای (سیستم های بسته و محیط کشت های پیوسته ) در رابطه با شبیه سازی محیط شکمبه دارای مزایا و معایبی هستند. هانگیت، پدر علم میکروبیولوژی شکمبه با اشاره به پژوهشی که مارکوف درسال ۱۹۱۳ گزارش می کند که انکوباسیون های کوتاه مدت برآورد های واقعی تری از فراسنجه های تخمیر نسبت به انکوباسیون های بلند مدت در محیط های آزمایشگاهی هستند. متن واقعی که هانگیت از مارکف نقل قول می کند این چنین است: «دقیق ترین نتایج زمانی بدست می آید که محتویات شکمبه با حداکثر سرعت ممکن از شکمبه منتقل شده و تخمیر فقط برای ساعات کوتاهی انجام شود».

همچنین در ادامه ذکر می نماید که «مطالعات آزمایشگاهی که به طور معمول انجام می شوند نمی توانند برآوردهای دقیق و کاملاً واقعی از آنچه واقعاً در شکمبه اتفاق می افتد ارائه دهند. مطالعات بسیار کوتاه مدت آزمایشگاهی (تخمیر در زمان های بسیار کوتاه) می تواند چنین اطلاعات واقعی را فراهم کنند. نظریه ای که موید این تکنیک (تخمیر کوتاه مدت) است بر این مبنا استوار است که یک نمونه از محتویات شکمبه پس از خروج از شکمبه به فعالیت خود ادامه می دهد تا جایی که محصولات نهایی تخمیر، اتمام سوبسترا و مواد غذایی و یا عوامل دیگر باعث تغییر آن گردند. این روش ها از نظر تئوری قابل اجرا بوده ودر بسیاری از موارد هم برای برآورد فعالیت باکتریها در شکمبه انجام گردیده است. با انکوباسیون در شرایط آزمایشگاه در یک زمان کوتاه از چند ثانیه تا چندین ساعت، تغییرات در جمیعت میکروبی شکمبه به شدت اتفاق افتاده و با جمعیت واقعی شکمبه متفاوت می گردد و این تغییرات به خصوص در مورد باکتری های بی هوازی اتفاق می افتد درحالی که دما و اسیدیته مناسب حفظ شده است(Dehority, 2005) .
در مطالعات شکمبه ای که تخمیر برای ساعات بیشتری ادامه می یابد، محصولات نهایی تخمیر در محیط تجمع پیدا کرده و جمیعت میکروبی شروع به تغییر می کندو بنابراین عدم توانایی در خارج کردن محصولات نهایی تخمیراز محیط های شبیه سازی شده آزمایشگاهی یکی از عیوب معنی دار سیستم های آزمایشگاهی بسته در قیاس با محیطهای کشت پیوسته در انکوباسیون های طولانی می باشد.
در مورد اسانس های گیاهی هم مانند سایرموادی که از نظر زیستی فعال می باشند، محققین بایستی به اصلی ترین سوال پاسخ دهند و اینکه: سازش پذیری و یا اثرات جمعیت میکروبی شکمبه در غیرفعال کردن و یا تشدید اثرات این مواد مورد مطالعه چیست؟ ظاهراً این سوال در مورد سیستم های بسته انکوباسیون در آزمایشگاه قابل پاسخ دادن نیست همچنین بسیار ساده انگارانه است که ادعا کنیم این سوال در مورد سیستم های کشت پیوسته در آزمایشگاه بطور کامل قابل پاسخگویی است و اثرات ترکیبات زیستی بر روی الگوی تخمیر در شکمبه در دراز مدت، فقط در سیستمهای زنده و بیولوژیک قابل بررسی می باشد. سیستمهای آزمایشگاهی فقط می توانند محققین را در اثرات احتمالی و ممکن سیستم های بیولوژیکی راهنمایی کنند اما آزمایشات نهایی فقط بایستی درمحیط های بیولوژیکی انجام شود. آزمایشات بیولوژیک (البته نه در مورد تمامی طرح های آزمایشی) برای مطالعه اثرات شکمبه ای کافی است(Dehority, 2005).
با وجود تمامی معایب ذکر شده در بالا برای سیستم های آزمایشگاهی، استفاده از این سیستم ها تا راه حل عملی برای مطالعه تعداد بسیار زیاد این ترکیبات و از جمله اسانس های گیاهی می باشد. زمانی که تعداد ترکیبات مورد مطالعه پس از انجام مطالعات آزمایشگاهی کافی، کم می شود بایستی آنها در سطوح دیگری از آزمایش یعنی آزمایشات بیولوژیکی آزمون گردند.

۲-۲۵- تاثیر اسانس ها بر متابولیسم پروتئین

نشخوارکنندگان از نیتروژن خوراک به طور ناکارآمدی استفاده می کنند. به عنوان مثال تبدیل انتقال نیتروژن خوراک به پروتئین شیر بطور متوسط ۱۴/۰ ۷/۲۴ درصد با دامنه حداقل ۷/۱۳ و حداکثر ۸/۳۹ درصد تعیین شده است به طوری که نیتروژن باقیمانده به صورت ادرار و مدفوع به محیط دفع می شود. بنابراین نیتروژنی که در تولید پروتئین شیر استفاده نشده و مورد استفاده دام برای رشد قرار نمیگیرد، باعث آلودگی هوا، خاک و آب می شود. موضوعات مهم زیست محیطی نظیر آلودگی سفره آب های زیرزمینی، انباشتگی آب درتالاب ها و رودخانه ها و کمی اکسیژن آنها، باران های اسیدی، تشکیل ذرات ریز (نظیر PM_2.5) تمامی اینها می توانند تاحدی منسوب به حیوانات اهلی و دام ها و عدم کارایی آنها در مورد استفاده قرار دادن نیتروژن باشد. چنانچه نیتروژن تجزیه شده در شکمبه بیشتراز نیاز میکروارگانیسم ها باشد قسمت عمده آن در پروتئین سازی مورد استفاده واقع نمی شود و از طریق ادرار دفع می شود. و لذا بهبود بازده نیتروژن هدف اصلی تغذیه نشخوار کنندگان است(Hristov et al., ۲۰۰۵).

در سالهای اخیر مطالعات آزمایشگاهی زیادی به منظور بررسی اثرات اسانس های گیاهی و ترکیبات آنها برتخمیر میکروبی شکمبه انجام گرفته است و تعداد زیادی از این مطالعات از تکنیک های آزمایشگاهی بسته و در زمان های کوتاه استفاده کرده اند و تعداد زیادی از اسانس های گیاهی و ترکیبات مربوطه آنها را با دزهای مختلف، مورد مطالعه قرار داده و نتایج هم به طور معنی دار و اساسی متفاوت نبوده است.
تحقیقات انجام گرفته به وسیله گروه رووت^۱[۱۶] پیشنهاد می کند که بازدارندگی های انتخابی در شکمبه توسط مخلوط خاصی از ترکیبات موثره اسانسهای گیاهی ایجاد می شود که شامل: تیمول، ایوجینول، وانیلین ولیمونین می باشند (McIntosh et al., ۲۰۰۳). در آزمایشی بر روی شیرابه شکمبه جمع آوری شده از گاوهای شیری که با جیرهای بر پایه ذرت سیلو شده تغذیه می شدند و هر رأس گاو روزانه یک گرم از مخلوطی از اسانس های گیاهی دریافت می کرد، انکوباسیون این شیرابه ها به مدت ۴۸ ساعت در محیط بسته آزمایشگاهی منجر به کاهشی ۹ درصدی در فعالیت آمین زدایی دراین شیرابه ها گردید(McIntosh et al., ۲۰۰۳). اثر بازدارندگی مخلوط این اسانس های گیاهی بر روی فعالیت آمین زدایی بعدها در آزمایشی دیگر توسط نیوبولد و همکاران (۲۰۰۴) و به مدت ۲۴ ساعت انکوباسیون انجام شده بود، تایید گردید. دراین آزمایش که برروی گوسفندانی که روزانه ۱۱۰ میلی گرم از مخلوط اسانس های گیاهی را دریافت میکردند انجام شد و کاهشی ۲۵ درصدی در فعالیت آمین زدایی مشاهده شد. به هر حال در آزمایشات بیولوژیک بعدی، غلظت نیتروژن آمونیاکی شکمبه تحت تأثیر افزودن مخلوط اسانسهای گیاهی تجاری قرارنگرفت. در مطالعات بعدی مکینتاش و همکاران (۲۰۰۳) مشاهده کردند که مخلوطی از اسانس های گیاهی می توانند رشد سویه هایی از باکتری ها که مقدار زیادی نیتروژن آمونیاکی تولید می کنند (مانند: کلستریدیوم استیک لاندی و پپتواسترپتوکوکوس آن انائروبیوس) را محدود کرده در حالی که همزمان اثری بر رشد برخی دیگراز باکتری های این دسته نظیرکلستریدیوم آمینوفیلوم نداشتند. کاستیلجوس و همکاران (۲۰۰۵ و ۲۰۰۷)، زمانی که اسانسهای گیاهی را به محیط کشت پیوسته آزمایشگاهی به میزان های ۵/۱، ۵، ۵۰ و ۵۰۰ میلیگرم در هر لیتر محیط کشت در اسیدیته ثابت (pH=6.4) اضافه کردند، مشاهده کردند که این مخلوط در تغییر متابولیسم نیتروژن در شکمبه بی تأثیر می باشد (غلظت های نیتروژن آمونیاکی، نیتروژن پپتیدهای بزرگ، پپتیدهای کوچک همراه بانیتروژن های اسید آمینه ای، جریان نیتروژن جیرهای و باکتریایی، تجزیه پذیری نیتروژن و بازده سنتز پروتئین میکروبی توسط میکروب ها تحت تأثیر قرار نگرفت).
علت موثر نبودن مخلوطی از اسانسهای گیاهی در چنین مطالعاتی احتمالاً مربوط به کافی نبودن مقدار اسانس استفاده شده در آزمایش و عدم توانایی آن در تغییر جمعیت میکروبی شکمبه است. مکینتاش و همکاران (۲۰۰۳) گزارش کردند برای آن که اسانس های گیاهی بتوانند رشد برخی از باکتریهای غالب شکمبه مانند باکتری هایی که مقدار زیادی نیتروژن آمونیاکی تولید می کنند ( ماند: کلستریدیوم استیک لاندی و پپتواسترژتوکوکوس آن آنائروبیوس) را محدود سازند، بایستی حداقل به مقدار ۴۰ میلی گرم در هر لیتر استفاده شوند. این مقدار پیشنهاد شده ازمقادیر استفاده شده در آزمایشات درون تنی می باشد ( Hart et al ، ۲۰۰۳). در واقع نتایج حاصل از مطالعات درون تنی Benchaar et al., ۲۰۰۶a , 2007a ، نشان داد که استفاده روزانه ۷۵/۰ و ۲ گرم از مخلوطی از اسانس های گیاهی درتغذیه گاوهای شیری، اثری بر روی غلظت نیتروژن آمونیاکی شکمبه و همچنین هضم پذیری و ابقاء نیتروژن شکمبه نداشت. (McIntosh et al., ۲۰۰۳).
اثر اسانس های گیاهی بر متابولیسم پروتئین درشکمبه به وسیله تکنیک کیسه های نایلونی نیز بررسی شده است و نتایج در مطالعات گوناگون بر حسب نوع منبع پروتئین استفاده شده در آزمایش، ترکیبات جیره و میزان اسانس مصرف شده کاملاً متفاوت بود. مولر و همکاران (۲۰۰۴)، بر روی تلیسه های درحال رشد آزمایشی انجام دادند و جیره های حاوی کنسانتره بالا به مدت ۱۰ با روزانه ۷۰۰ میلی گرم از مخلوطی از اسانس های گیاهی مکمل کردند و در نتیجه کاهش اندکی را در تجزیه پذیری موثر پروتئین در شکمبه گزارش کردند که مقدار این کاهش در مورد بذر لوپین، نخود سبز و کنجاله آفتابگردان به ترتیب ۳، ۶ و ۵ بود. زمانیکه جیره پایه شامل مقادیر پایینی از کنسانتره بود این کاهش در تجزیه پذیری موثر پروتئین فقط در مورد نخود سبز کاهش اندکی (۲-) نشان داد.
هارت و همکاران (۲۰۰۸)، بر مبنای نتایج بدست آمده از آزمایاشات مولر و همکاران (۲۰۰۴) چنین نتیجه گرفتند که اثرات اسانس های گیاهی خاص بر روی تجزیه پذیری پروتئین در شکمبه انتخابی بوده و بیشتر تحت تأثیر اثرات مشخص منبع پروتئین باتجزیه پذیری سریع در شکمبه قرار می گیرد. با این حال کاهش های مشاهده شده در تجزیه پذیری پروتئین در آزمایش ها، بسیار کمتر از آن است که بتواند اثر تغذیه ای نامطلوبی روی متابولیسم پروتئین در شکمبه بگذارد.

* مخلوط اسانس های گیاهی حاوی: تیمول، ایوجینول، وانیلین، گوایکول و لیمونین