شکل۳-۲-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت صفر

۶۰

شکل۳-۳-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت ۳ پس از کشت

۶۱

شکل۳-۴-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت ۲۰ پس از کشت

۶۲

شکل ۳-۵-بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی در زمان صفر بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین

۶۳

شکل ۳-۶-بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی ۳ ساعت پس ازکشت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین

۶۴

شکل ۳-۷- بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی ۲۰ ساعت پس از کشت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین

۶۵

فصل اول
مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته
۱-۱-­­­­­مقدمه
به واسطه ی پیشرفت های امروزه در زمینه­ درمان بیماری سرطان، تعداد افراد بهبود یافته از آن به طور چشم گیری افزایش یافته است، به گونه ای که حدود ۸۰% از کودکان مبتلا به سرطان که تحت درمان بوده اند، سلامتی خود را مجددا به دست آورده اند (۱)، ولی با این وجود حدود یک سوم این کودکان به دلیل حساسیت بالای سلول های اسپرماتوگونی موجود در بیضه، دچار اختلال عملکرد سیستم باروری و ناباروری شده اند (۲). بدلیل عدم امکان حفظ باروری از طریق انجماد اسپرم در کودکان نابالغ می توان از انجماد و نگهداری بافت بیضه با هدف پیوند بافت، کشت بافت و یا پیوند سلول های آن به عنوان یک استراتژی مناسب جهت حفظ باروری استفاده کرد (۳). علاوه بر کودکان مبتلا به سرطان می توان از این روش، برای حفظ باروری در افراد بزرگسال (۴)، افراد مبتلا به بیماری های سیستمیک و بیماری های خونی (۵)، گنادکتومی ها (۶)، سندرم کلاین فلتر (۷)، کریپتورکیدیسم (۸) و غیره استفاده کرد. از دیگر مزایای این روش حفظ منابع ژنتیکی حیوانات در معرض خطر انقراض است.

۱-۲-انجماد
انجماد تکنیکی است که به بررسی اثرات دماهای پایین بر ارگانیسم های زنده می پردازد. یکی از مهمترین کاربردهای آن، حفظ باروری در انسان و موجودات مختلف است. در روش های مختلف انجمادی، نمونه های انجمادی در معرض دماهای بسیار پایین (۱۹۶- درجه سانتیگراد) قرار می گیرند. این دما قادر است بافت انجمادی را در کمتر از یک دقیقه تخریب کند، اما استفاده از غلظت های مناسب ضدیخ در فرایند انجماد سبب حفظ و نگهداری بافت انجمادی تا سالهای متمادی می گردد. انجماد بافت بیضه در مقایسه با انجماد سوسپانسیون سلولی و یا انجماد سلول های اسپرماتوگونی بدلیل حفظ تمامی سلولهای موجود در بافت بیضه، حفظ سلولهای اسپرماتوگونی در کنام اصلی و نگهداری سلولهای اسپرماتوگونی و سرتولی در کنار یکدیگر و حفظ بر همکنش این سلولها بر هم بسیار کاربردی و حایز اهمیت است.
۱-۲-۱-تاریخچه ی انجماد
گلیسرول اولین ضدیخی بود که به صورت تصادفی در سال ۱۹۴۹ توسط Polge برای حفظ اسپرم ماکیان استفاده شد (۹) و پس از آن پژوهشگران برای انجماد اسپرم گاو و تخمک از آن استفاده کردند (۹). با گذر زمان و بهبود روش های انجمادی، از ضدیخ ها برای حفظ جنین نیز استفاده شد. یک دهه پس از کشف گلیسرول به عنوان ضدیخ، DMSO^[1] به عنوان ماده ی انجمادی با خاصیت حفاظتی بالا معرفی شد (۱۰).
مطالعات نشان می دهند که انجماد بافت، به دلیل حفظ عملکرد سلول هدف (برای مثال سلول اسپرماتوگونی در بافت بیضه) که وابسته به سایر سلول های موجود در کنام سلولی (برای مثال سلول سرتولی در بافت بیضه) است از اهمیت بالایی برخوردار است. اولین بافتی که با موفقیت منجمد شد، بافت تخمدان و با بهره گرفتن از ضد یخ گلیسرول بود و نتیجه­ پیوند پس از انجماد این بافت نیز امید بخش بود (۱۱-۱۳). در دهه­ ۱۹۹۰ مطالعاتی در زمینه ی انجماد و پیوند سلول­های اسپرماتوگونی انجام شد، که نتیجه­ آن شروع اسپرماتوژنزیس سلول های اسپرماتوگونی پس از پیوند بود (۱۴-۱۶). تا مدت ها به دلیل عدم کاربرد بافت بیضه منجمد شده، بافت بیضه منجمد نمی شد، تا اینکه در سال ۲۰۰۲ انجماد و پیوند موفقیت آمیز بافت بیضه انجام شد (۱۷, ۱۸). بنابراین این علم نو پا بوده و محققین در تلاش برای بهبود روش ها هستند.
۱-۲-۲ تکنیک های مختلف انجمادی
محققان روش های مختلفی از جمله انجماد سلول های زایای حاصل از هضم آنزیمی بافت بیضه (۱۹) و یا انجماد قطعات کوچکی از بافت بیضه را که حاوی سلول های اسپرماتوگونی و سلول های سرتولی هستند (۲۰) به منظور حفظ باروری استفاده کرده اند. انجماد بافت بیضه با دو روش انجماد آهسته^[۲] و انجماد شیشه ای^[۳] انجام میشود. تا مدت ها انجماد بافت بیضه (۸, ۲۱, ۲۲) و انجماد سوسپانسیون سلول های زایا (۱۹) با بهره گرفتن از تکنیک انجماد آهسته انجام می شد تا اینکه در سال ۲۰۱۱، Curaba و همکارانش انجماد شیشه ای بافت بیضه ی موش را انجام دادند (۲۳). لازم به ذکر است که غلظت ضدیخ مورد استفاده، زمان قرارگیری در معرض ضدیخ و سرعت کاهش دما در تکنیک های مختلف انجمادی با یکدیگر تفاوت دارند.
۱-۲-۲-۱-انجماد آهسته
انجماد آهسته به عنوان یک روش مناسب برای حفظ بافت بیضه معرفی شده است. در این روش از غلظت های پایین ضدیخ (M 2-5/0) به منظور کاهش آسیب سلولی و کاهش اثر سمیت ضدیخ ها استفاده می شود، ولی طولانی بودن زمان قرارگیری در معرض ضدیخ سبب اعمال اثر سمیت ضد یخ بر سلول می گردد (۲۴). در روش انجماد آهسته وجود ضدیخ در محیط انجمادی باعث کاهش سرعت تشکیل کریستال یخ در فضای برون سلولی و جلوگیری از تشکیل یخ در داخل سلول در حین فرایند کاهش دما می شود. تشکیل یخ در محیط خارج سلولی سبب تغلیظ محیط انجمادی و ایجاد شیب غلظتی از خارج به داخل سلول شده، که این حالت باعث آبگیری سلول ها میشود. آبگیری از سلول ها اثرات مخربی را بر ساختار غشا و ملکول هایی که با ساختار غشا در ارتباط هستند اعمال می کند و در این حالت ارگانل ها و ملکول هایی که در شرایط عادی به دلیل وجود آب از یکدیگر جدا بوده اند به یکدیگر نزدیک شده و ممکن است به دلیل میانکنش هایی که میان آنها صورت می گیرد اثرات تخریبی بر سلول ها اعمال گردد، این اثر مخرب با نفوذ ضدیخ در داخل سلول خنثی می شود .(۲۵) طولانی بودن مدت زمان قرارگیری سلول ها در معرض ضد یخ و گران قیمت بودن فریزر­های انجماد آهسته از جمله نقاط ضعف این روش انجمادی است (۲۶).
۱-۲-۲-۲-انجماد شیشه ای
در انجماد آهسته، تشکیل کریستال یخ خارج سلولی در ساختار بافتی، موجب آسیب به غشای سلول و بافت می گردد. روش جایگزین برای جلوگیری از تشکیل یخ در ساختار بافت تبدیل آب به حالت شیشه ­ای است، در این حالت با اضافه کردن مقادیر بالای ضدیخ به محیط انجمادی، از اجتماع مولکولهای آب و تشکیل یخ در فضای خارج سلولی ممانعت شده و نهایتا میزان آسیب وارده به سلول ها در حین انجماد کاهش می یابد. بدین ترتیب اغلب سلولها از لحاظ ظاهری سالم هستند و فقط ساعت بیولوژیک آنها متوقف شده است. با وجود آسیب سلولی کمتر در روش انجماد شیشه ای، احتمال آسیب به سلولها در اثر غلظت بالای ضدیخ مورد استفاده همواره باید مد نظر قرار گیرد (۲۷).
۱-۲-۳-محلول های انجمادی
کلیه ی محلول ها ی انجمادی ترکیبی از ضد یخ ها، سرم و محیط پایه هستند.
۱-۲-۳-۱-ضدیخ ها
ضدیخ ها به طور کلی به دو دسته ی ضد یخ های نفوذپذیر و نفوذناپذیر تقسیم می شوند. ضدیخ های نفوذ پذیر دارای قابلیت عبور از غشای سلول بوده و باعث کاهش سرعت تشکیل کریستال یخ در حین سردشدن در داخل سلول ها می شوند از جمله ضدیخ های نفوذ پذیر می توان گلیسرول، دی متیل سولفوکسید، اتیلن گلیکول^[۴] و پروپاندیول^[۵] را نام برد(۲۴, ۲۸). ضدیخ های نفوذ ناپذیر با افزایش ویسکوزیته ی محیط اطراف سلول از تشکیل کریستال یخ در اطراف سلول و آسیب به غشای سلول جلوگیری می کنند، دی ساکارید ها مانند سوکروز^[۶] و ترهالوز^[۷] از جمله ضدیخ های نفوذ ناپذیر هستند (۲۸).
الف: عملکرد ضدیخ های نفوذ پذیر
ضدیخ های نفوذپذیر بواسطه ی خاصیت آبدوستی بالای خود، با ملکول های آب موجود در محیط کشت میانکنش می دهند، این میانکنش موجب افزایش نفوذ ضدیخ به داخل سلول می شود. وجود ضدیخ در فضای داخل سلول باعث بالا رفتن ویسکوزیته ی مایع درون سلول و کاهش دمای لازم برای تشکیل کریستال یخ در داخل سلول می­­گردد، بنابراین استفاده از غلظتهای بالای ضدیخ، باعث افزایش ویسکوزیته ی داخل سلول، جلوگیری از تشکیل و تجمع هسته های یخی و در نتیجه جلوگیری از آسیب غشایی می شود. خروج آب در حین فرایند آبگیری از داخل سلول، باعث چروکیدگی سلول و افزایش غلظت نمک ها در داخل سلول می شود که می تواند اثرات نامطلوبی بر سلول اعمال نماید. نفوذ ضدیخ به داخل سلول، با رقیق سازی مواد موجود در سلول، سبب جلوگیری از اثرات نامطلوب ناشی از میانکنش های مضر میان ترکیبات مختلف داخل سلول می گردد (۲۸).
ب: عملکرد ضدیخ های نفوذ ناپذیر
ضد یخ های نفوذ ناپذیر مانند ترهالوز و سوکروز با وجود وزن مولکولی بالا نمی توانند به داخل سلول نفود کنند و با افزایش اسمولاریته در محیط اطراف سلول به فرایند آبگیری کمک کرده و همچنین با افزایش ویسکوزیته ی محیط کشت باعث کاهش دمای تشکیل کریستال یخ در حین انجماد می شوند (۲۴, ۲۸).
ج: عملکرد مشترک ضدیخ های نفوذ پذیر و ضد یخ های نفوذ ناپذیر