در سال ۲۰۰۳ لانگ و همکارانش در پیدا کردن جهش V600E در رده ی سلول های لایه ی زاینده در ۴۲ مورد از سرطان ملانومای فامیلی به شکست برخورد کردند.
در سال ۲۰۰۳ نامبا و همکارانش فرکانس جهش های را در سرطان تیروئیدو ارتباط آن ها را با پارامترهای پاتولوژیکی مشخص کرد.جهش V600E در ۴ رده ی سلولی از ۶ رده ی سلولی و ۵۱ مورد از ۲۰۷ مورد سرطان تیروئید یافت شد.
در سال ۲۰۰۴ دومینگو و همکارانش متذکر شدند که جهش های داغ V600E که در سرطان های کلورکتال یافت شد در اثر جهش در ژن های ترمیم کننده ی اشتباهات (MMR) DNA مثل MLH₁ و یا MSH₂ است که این ها به ارث رسیده شده است.
لوبرمیرشکی و همکارانش در سال ۲۰۰۵، ۴۵ مورد از سرطان کلورکتال را که ناپایداری ریز ماهواره داشتند (MSI) و ۳۷ مورد سرطان کلورکتال که بدون ناپایداری ریز ماهواره بودند ولی مشخصات پاتولوژیکی مشابهی داشتند را بررسی کردند و یافتند که جهش BRAF بیشتر در تومورهایی مشاهده شد که MSI یا ناپایداری ریز ماهواره ها را داشتند. بیشترین تغییر شایع BRAF، V600E فقط در تومورهایی که MSI یا ناپایداری ریز ماهواره ها را داشتند،و با متیلاسیون پروموتور MLH₁ و نقص MLH₁ ارتباط داشتند محاسبه شد.سن متوسط بیمارانی که جهش BRAF V600E را داشتند نسبت به بیمارانی که جهش V600E را نداشتند بیشتر بود.
در سال ۲۰۰۹ به وسیله ی تول و همکاراش یک جهش V600E سوماتیک در ۴۵ مورد از ۵۱۹ (۷/۸%) مورد سرطان کلورکتال که این جهش را داشتند مشاهده شد.
در مطالعه ای که توسط YUو همکارانش در سال ۲۰۱۳ انجام شد جهش هایBRAF در اندومتریوز و هایپریازیا مورد بررسی قرار گرفت. در این مطالعه جهش های موجود در اگزون شمار ه۱۱ و ۱۵ ژن BRAF، در ۹۷ بیمار کارسیومای آندومتر،۹ مورد هایپر پلازیای غیر نرمال و ۲۰ مورد آندومتریال نرمال مورد تحقیق قرار گرفت. از ۹۷ مورد کارسینوما و ۹ مورد هایپرپلازی ۲۰ مورد ( ۲۱%) و ۱ مورد(۱۱%) جهش هایBRAF داشتند که در مطالعات قبلی تاکنون گزارش نشده بود. ۲۰ مورد از اندومتریوم نرمال و ۲۱ نمونه از اندومتریوم نرما ل که در نقاط کناری نقاط جهش یافته بودند هیچ جهشی در BRAF نداشتند. هیچ تفاوت ظاهری نسبت به شیوع جهش BRAF در بین مراحل، زیر گروه بافتی، یا جدی جز آن ها نبود.
این یافته ها بیان داشت که جهش در ژن BRAF به میزان بسایر کمی در اندومتریوز موثر است.
در مطالعه ای که توسط Mutch و همکارانش در سال ۲۰۰۴ بر روی جهش RAS/RAF و نقص در سیستم ترمیم DNAدر سرطان اندومتریال انجام گرفت، ۱۴۶ نفر از افرادی که اندومتریوز داشتند برای جهش های BRAF مورد بررسی قرار گرفتند. ۳۵ نفر از این بیماران برای ژن KRAS2 دارای جهش بودند ولی فقط در یک مورد جهش در ژن BRAF یافت شد، در این تحقیق به این نکته رسیدند که با وجود تشابهات زیاد بین سرطان کلون و آندومتریوز، توسعه و گسترش سرطان اندومتریوز بسیار متفاوت از سرطان کلون است(۸۱).

مطالعه ای توسط KAWAGUCHI و همکارانش در سال ۲۰۰۹ برای جهش BRAF V600E در افراد مبتلا به سرطان آندومتریال انجام شد. در این مطالعه بیان داشتند که از زمانی که جهش هایی در KRAS وBRAFدر تعداد زیادی از مواردی که از نظر ناپایداری ریز ماهواره ها (MSI) در سرطان تک گیرکلون که در ژن MLH₁ نیزهایپرمتیله شده بودند، مثبت بودند مشاهده شد، ارتباطی بین MSIیا ناپایداری ریز ماهواره ها با کاهش بیان در هایپرمیتله شدن این مطالعه بر روی ۴۴ فرد بیمار انجام شد و جهش های نقطه ای در ۶ مورد از ۴۴ مورد ( %۶/۱۳) مشاهده شد ولی هیچ جهش در BRAF V600E بررسی نشد و به این نتیجه رسیدند که این جهش هدفی برای MMR در کارسینوژنز بیماران آندومتریوزنیست.پس برای یافتن ژن موثر در MMR در اندومتریوز باید مطالعات بیشتری انجام داد(۵۴).
فصل سوم:
مواد و روش ها
تمامی بیماران مبتلا به میوم ، بستری در بیمارستان میرزا کوچک خان وابسته به دانشگاه تهران مورد ارزیابی اولیه قرار گرفته و پس از بیماری یابی و تائید بیماری توسط متخصص زنان و زایمان، مشاوره و ثبت اطلاعات پرسشنامه طرح تحقیقاتی از طریق مصاحبه با بیمار و مطالعه پرونده ی بیمار انجام یافته و افراد کاندید برای بررسی انتخاب می گردند که پس از کسب رضایت اولیاء و همراهان با نمونه گیری از افراد مبتلا و در صورت امکان خانواده ی آنان به میزان cc 5 خون حاوی ماده ضد انعقاد EDTA ، استخراج DNAصورت پذیرفته و با بهره گرفتن از دستگاه نانودراپ کیفیت سنجی نمونه ها انجام پذیرفته و از هر بیمار حداقل ۱۰۰ میکرولیتر DNA تهیه گردیده و جهت بررسی مولکولی استفاده می گردد ، انتخاب و طراحی پرایمرهای PCR جهت بررسی جهش های موردنظر بر اساس منابع و مطالعات قبلی صورت پذیرفته و طراحی پرایمرها با بهره گرفتن از نرم افزارهای Online شامل Primer3plus, Primer design NCBI و نیز نرم افزارهای Gene runner صورت می پذیرد.
انجام بررسی ملکولی به روش TETRA ARMS-PCRدر ابتدا بر روی نمونه افراد بیمار صورت پذیرفته و سپس بر روی گروه کنترل انجام می پذیرد،بررسی درافراد سالم به عنوان کنترل و انتخاب تصادفی آن ها انجام می شود.
در این بررسی با توجه به دسترسی مشکل و هزینه های بالای بررسی تعداد ۵۰ بیمار مبتلا و ۵۰ فرد سالم مورد ارزیابی قرار می گیرند.
۳-۱ روش ها
۳-۱-۱ روش جمع آوری نمونه های خون
۳-۱-۱-۱ انتخاب بیماران
در این مطالعه،۵۰ بیمار مبتلا به میوم رحمی که در بیمارستان میرزا کوچک خان تهران بستری شده بودند و توسط پزشک متخصص تحت عمل جراحی قرار گرفته بودند انتخاب و جمع آوری شدند.علاوه بر این،سایر اطلاعات بیماران توسط فرم پرسشنامه تکمیل گردید ( پیوست ۱ ).
۳-۱-۱-۲ انتخاب افراد کنترل
تعداد ۵۰ نفر از افراد بستری در همان بیمارستان که به دلیل دیگری غیر از میوم بستری شده بودند و بیماری میوم در آن ها رد شده بود انتخاب و جمع آوری شدند.
۳-۱-۱-۳ خون گیری و شرایط نگهداری نمونه ها
مقدار ۲ تا ۵ سی سی از نمونه خون افراد بیماروکنترل در لوله های حاوی ماده ضد انعقاد EDTA ریخته شد.این نمونه ها ابتدا در یخچال و سپس تا زمان استخراج در دمای ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.
۳-۱-۲ استخراج DNA از خون به روش Soulthing out
در این مطالعه از روش soulthing out جهت استخراج DNA از نمونه های خون استفاده شد.
این روش نیز طی دو مرحله انجام گرفت.
مرحله اول
۵۰۰ml خون را در ویال ۱٫۵ml قرار می دهیم.
اضافه نمودن ۱۰۰۰ml آب مقطر سرد به ویال و پپتینگ نمودن آن.سپس آن را در سانتریفوژ قرار داده و با دور ۱۰۰۰۰rpm به مدت ۲۰ دقیقه سانتریفوژ می کنیم.(این عمل را تا سه بار تکرار می نماییم).
اضافه نمودن ۳۰۰ml N-lysis به رسوب بر جای مانده و پپتینگ نمودن آن جهت لیز شدن هسته و سپس آن را به مدت ۲ ساعت در دمای آزمایشگاه قرار می دهیم.
اضافه نمودن ۲۵۰ ml NACL₂ اشباع و ورتکس نمودن آن جهت حذف پروتئین ها
اضافه نمودن ۶۰۰ml کلروفرم و ورتکس نمودن آنها و سپس نمونه ها را در ۴۵۰۰rpm به مدت ۴ دقیقه سانتریفوژ می کنیم.( به منظور جدا شدن DNA از سایر قسمت ها به واسطه تشکیل دو فاز مختلف).
بعد مایع رویی را در یک میکروتیوپ جدید ریخته سپس ۱۰۰۰ml اتانول سرد مطلق به آن اضافه می کنیم جهت کریستاله شدن DNA. سپس درب ویال را پارا فیلم می زنیم و آن را به مدت ۲۴ ساعت در یخچال نگه داری می کنیم.
مرحله دوم
روز بعدابتدا نمونه ها را در ۱۰۰۰۰rpm به مدت ۲ دقیقه سانتریفوژ می کنیم جهت رسوب DNA . اگر DNA مشاهده نشد به مدت ۲۰ دقیقه با دور ۱۴۰۰۰rpm سانتریفوژ می کنیم.
سپس مایع رویی را دور ریخته و شستشوی نهایی با الکل ۷۰٪ به مقدار ۲۵۰ml انجام می دهیم. (این کار را تا سه بار تکرار می کنیم و هربار در ۱۰۰۰۰rpm به مدت ۱ دقیقه سانتریفوژ می کنیم).در آخرین بار الکل را دور ریخته و در ویال را باز گذاشته تا الکل کاملا خشک شود.
اضافه کردن ۷۰-۱۰۰ml آب مقطر جهت حل شدن رسوب DNA .
۳-۱-۳ تعیین کمیت وکیفیت DNA استخراج شده
۳-۱-۳-۱ ارزیابی کمیت DNA به روش اسپکتروفتومتری
درهنگام کار با دستگاه اسپکتروفتومتری به منظور کالیبره نمودن دستگاه، ۵۰ میکرولیتر آب دوبار تقطیر یا بافر TE به کووت مخصوص دستگاه اضافه کرده و در دستگاه قرارداده و با انتخاب گزینه ی Blank و مشاهده ی عدد صفر، دستگاه کالیبره می شود.در ادامه برای هر نمونه به مقدار ۴۵ میکرولیتر آب مقطر یا بافرTE و ۵ میکرولیتر محلولDNA به درون کووت اضافه شده و پس از قرار گیری در دستگاه و انتخاب گزینه ی Sample میزان جذب نوری محلولDNA در طول موج های مورد نظر و نیز غلظت DNA برحسب میکروگرم بر میلی لیتر نشان داده می شود.هرگاه OD 260 به ۲۸۰ در محدوده ی ۲ـ ۸/۱ باشد، نشان دهنده ی این مطلب است که DNA از خلوص مناسبی جهت استفاده در PCR برخوردار است.بنابراین هر کدام از نمونه ها که مقدار جذب آنها در این محدوده قرار گرفت و دارای غلظت ۱۵۰ نانوگرم بر میکرولیتر و یا بیشتر هستند به عنوان نمونه هایی که استخراج آن ها به درستی انجام گرفته بود، جهت PCR انتخاب شدند.نسبت های کمتر از ۸/۱ نشانگر آلودگی با پروتئین است.
نسبت های بالاتر از ۲ نشان دهنده ی وجود RNA است.بنابراین استخراج نمونه هایی که OD آن ها در محدوده ی مطلوب قرار نداشت، مجدداً انجام گرفت.
۳-۱-۳-۲ارزیابی کیفیتDNA توسط ژل آگارز
در این روش ۳ میکرولیتر از هر نمونه DNA به همراه ۱ میکرولیتر بافر بارگیری در چاهک ژل آگارز ۱% بارگذاری گردید. پس از الکتروقورز با ولتاژ۱۰۰ به مدت۳۰ دقیقه، با توجه به شدت باند حاصل، حجم مناسب از محصول استخراج شده جهتPCR تعیین گردید.DNA استخراج شده از خون جهت آزمایشات بعدی در فریزر۲۰ – نگهداری می شوند.
۳-۱-۴روش الکتروفورز بر روی ژل آگارز
الکتروفورز بر روی ژل، که در سال ۱۹۵۰ توسط اولیور اسمیت^[۲۱] ابداع شد، به مجموعه تکنیک هایی اطلاق
می شود، که با بهره گرفتن از ویژگی های فیزیکی نظیر اندازه، شکل یا نقطه ایزوالکتریک یک ملکول، اقدام به جداسازی آن می نماید.این تکنیک در واقع نوعی کروماتوگرافی جامد افقی تسهیل شده توسط نیروی الکتریکی بر روی شبکه ایجاد شده در بستری از جنس آگارز^[۲۲] یا پلی‌اکریل آمید^[۲۳] است، که به منظور بررسی های کیفی پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک بکار می رود.کاربرد معمول این تکنیک در بررسی های آنالیزی است، اما می توان از آن بعنوان یک تکنیک مکمل برای خالص سازی اختصاصی یک ملکول هم یاد کرد. وجه تسمیه “ژل” در بخش اول نام تکنیک ماتریکس مورد استفاده برای جداسازی ملکول مد نظر است. ژل مورد استفاده در این تکنیک در اغلب موارد پلیمر متخلخلی است که ترکیب و ضریب تخلخل آن بر مبنای نوع و وزن ملکول مد نظر انتخاب می شود.برای جداسازی ملکول های پروتئین و اسید نوکلئیک های کوچک، معمولاً از ژل پلی آکریل آمید استفاده می شود؛ که در واقع ترکیب غلظت خاصی از آکریل آمید به همراه یک رابط است.آگارز خالص استخراج شده از جلبک قرمز، ترکیب کاندید جداسازی ملکول های اسید نوکلئیکی بزرگتر از چند صد باز است.