بافر تنگو ۲x : 4 میکرولیتر
آنزیم Ncol : 1 میکرولیتر
آنزیم Xhol : 1 میکرولیتر
پلاسمید pet-28a نوترکیب : ۲ میکرولیتر
حجم نهایی واکنش : ۲۰ میکرولیتر
میکروتیوب را به مدت ۱ الی ۲ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد (دمای اپمتیوم واکنش آنزیم ها) قرار می دهیم.
الکتروفورز انجام داده تا قطعات پلاسمید و ژن CD166 شناسایی و تایید شوند.
۳-۶ بیان پروتئین CD 166
پس از تایید ترانسفورماسیون و وجود پلاسمید حاوی ژن CD166 در باکتری میزبان ، با توجه به پروموتر lac در پلاسمید pet-28a ، جهت القاء بیان پروتئین در باکتری از القاگر IPTG در رقت مناسب استفاده شد.
۳-۶-۱ القاء بیان پروتئین به کمک IPTG
مراحل کار بصورت زیر می باشد :
به ۲ میلی لیتر از محیط کشت LB حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین ، ۲۰ لاندا از باکتری BL21(DE3) ترانسفورم شده اضافه شد و به مدت یک شب در شیکرانکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد و با سرعت rpm 150 قرار داده شد و به آن اجازه دادیم تا رشد کند.
۲۰ لاندا از مخلوط موردنظر به ۲ میلی لیتر از محیط کشت LB تازه حاوی انتی بیوتیک کانامایسین اضافه شد و به مدت ۲ ساعت در شیکرانکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد با rpm 150 قرار داده شد تا غلظت باکتری موردنظر به OD به ۸/۰ برسد. بدین طریق باکتری ها تازه گشته و در فاز لگاریتمی خود قرار دارند.
۲۰ لاندا از القاگر IPTG با غلظت ۱۰۰ میکروگرم در میلی لیتر به ۲ میلی لیتر از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده اضافه شد و سپس به مدت ۶ ساعت در شیکرانکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد با سرعت rpm 150 قرار داده شد.
نکته : نمونه های کنترل منفی بدون افزوده شدن IPTG مورد بررسی قرار گرفتند.
مخلوط موردنظر به مدت ۵ دقیقه در ۴ درجه و با سرعت rpm 5000 سانتریفیوژ شد.
محلول روئی را دور ریخته و به رسوب آن لاندا ۶۰ اوره ۸ مولار اضافه شد و به کمک تکنیک SDS-page بیان پروتئین موردنظر مورد بررسی قرار گرفت.
۶-۳-۲ بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page
به منظور جداسازی باندهای پروتئینی سلولی و ردگیری پروتئین نوترکیب در سلول های ترانسفورم شده و نیز میزان بیان پروتئین موردنظر از الکتروفورز بر روی ژل پلی اکریل امید استفاده شد و عصاره های سلولی تهیه شده بر روی SDS-page الکتروفورز شدند. با توجه به این که وزن مولکولی پروتئین نوترکیب حدود ۵/۵۳ کیلو دالتون می باشد از ژل ۱۲% استفاده شد. برای بررسی بیان پروتئین نوترکیب از کیت ۸D8-page ساخت شرکت سیتومتین ژن اصفهان استفاده شد.

۳-۶-۲-۱ محتویات کیت ۸D8-page
محلول ذخیره آکریل امید و بیس آکریل امید ۴۰% : ۴۰ میلی لیتر
محلول بافر Running 10X : 25 میلی لیتر
محلول بافر Stacking 10X : 10 میلی لیتر
پودر محلول ذخیره SDS 10% : 5 میلی لیتر
پودر محلول ۱۰% آمونیوم پرسولفات (APS) : 5 میلی لیتر
پودر بافر Tank 10X : 400 میلی لیتر
محلول بافر ۲X SDS gel loading : 2 میلی لیتر
محلول رنگ آمیزی کوماسی بلو : ۳۰۰ میلی لیتر
محلول رنگ بر کوماسی بلو : ۴۰۰ میلی لیتر
محلول TEMED : 1 میلی لیتر
مواردی که موردنیاز است ولی در کیت موجود نیست : اتانول ، مارکر پروتئین
۳-۶-۲-۲ آماده سازی و توضیحات مربوط به محتویات کیت :
آکریل امید ۴۰%
این محلول باید در ظرف تیره و در دمای اتاق نگه داری شود زیرا نور و شرایط قلیایی باعث تسریع واکنش تبدیل آکریل امید و بیس آکریل امید به آکریلیک اسید و بیس آکریلیک اسید می شود.
بافر Running 10X
از این بافر برای تهیه ژل Running استفاده می شود.
بافر Stacking 10X
از این بافر برای تهیه ژل Stacking استفاده می شود. نکته مهم در مورد دو بافر شماره دو و سه اسیدیته آنهاست . در صورتیکه مدت زمان زیادی از زمان تهیه ی این بافرها گذشته باشد کیفیت و کارایی ژل در تفکیک پروتئین به شدت کاهش می یابد.
محلول ذخیره SDS 10%
برای تهیه محلول ذخیره SDS 10% ، پودر SDS موجود در بطری شماره ۴ را در ۵ میلی لیتر آب مقطر استریل گرم حل و سپس در دمای اتاق نگه داری شود.
محلول ۱۰% آمونیوم پرسولفات (APS)
آمونیوم پر سولفات رادیکال های آزاد را برای پلیمریزاسیون آکریل امید و بیس آکریل امید فراهم می نماید و نقش بسیار مهمی در بسته شدن ژل دارد.
این محلول بهتر است برای هر بار تهیه ی ژل به صورت تازه تهیه شود. برای تهیه این محلول ، ۰۵/۰ گرم پودر APS در ۵۰۰ میکرولیتر آب مقطر استریل حل شود. محلول ساخته شده را می توان در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگه داری نمود.
بافر Tank 10 X
از این بافر برای هدایت جریان الکتریسیته در ژل استفاده می شود. برای تهیه این بافر ، پودر محتوی شیشه شماره ۶ را در ۳۲۰ میلی لیتر آب مقطر حل کرده ، توسط اسید کلریدریک PH آن را در ۵/۸ تنظیم و سپس حجم نهایی آن را به ۴۰۰ میلی لیتر برسانید. بافر تهیه شده در این مرحله به صورت ۱۰ X می باشد و بنابراین برای استفاده بایستی آن را به نسبت ۱ به ۱۰ با آب مقطر رقیق نمود.