تیمار ۸: غیر ایمن و تغذیه شده با غذای معمولی فاقد عصاره.
شکل۲-۴ تیمار بندی ماهیان آزمایش
شکل ۲-۵ تزریق واکسن
۲-۳٫ نمونه گیری خون ماهیان
پس از بیهوش نمودن ماهی توسط ماده بیهوشی MS222 با دوز ۳۰ میلی گرم در لیتر بوسیله سرنگ انسولین آغشته به ماده ضد انعقاد هپارین از ورید ساقه دمی خونگیری انجام شد. پس از شماره گذاری لوله های آزمایش نمونه خون به مدت یک شب در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شده و سپس سرم آن با سانتریفوژ در ۳۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۵ دقیقه جداسازی گردید. سرم ها در ۲۰- درجه سانتیگراد تا زمان آنالیز نگهداری شدند(Stolen et al., 2000).
شکل۲-۶ نمونه گیری خون ماهیان آزمایش
۲-۴٫ آنالیزهای انجام شده روی نمونه ها
۲-۴-۱٫ اندازه گیری لیزوزیم
برای اندازه گیری میزان فعالیت لایزوزیم سرم از روش آگارز لیزوپلیت[۲۴] توصیه شده توسط (Osserman and Lawlor, 1966) و Roed et al., 1993)) با مقداری تغییرات استفاده گردید. در این روش ابتدا پودر آگارز به میزان ۱% در بافر ۱/۰ مول فسفات سیترات/ سیترات با ۸/۵=pH حل گردید. با حرارت دادن محلول به همراه هم زن مغناطیسی، بافر همراه آگارز به دمای جوش رسیده، به آرامی آگارز سرد گردید. وقتی دمای آگارز به حدود دمای ۵۰ درجه سانتیگراد رسید، میزان ۲/۰ میلی گرم به ازای هر میلی لیتر از پودر باکتری میکروکوکوس لیزودایکتیکوس (سیگما) به آگارز اضافه شده و قبل از تبدیل وضعیت آگارز از مایع به جامد، آگارز روی پتری دیش استریل ریخته شد تا بصورت لایه ای به قطر حدود ۵ میلی متر، جامد گردد. چاهک هایی به قطر ۴ میلی متر به فاصله ۵/۲ سانتی متر در ژل بوسیله پانچ های خاص ایجاد شده و سرم نمونه در سه تکرار به گوده ها اضافه گردید. ژل ها به مدت ۲۴ ساعت در شرایط اطاقک مرطوب و دمای ۲۵ درجه سانتیگراد انکوبه شده و سپس قطر هاله عدم رشد باکتری میکروکوک در اطراف گوده با خط کش دقیق، اندازه گیری شد. از رقت های متوالی لایزوزیم خالص مرغی (سیگما) نیز برای رسم نمودار فعالیت لایزوزیم به همین روش استفاده شده و در انتها میزان فعالیت لیز سلولی سرم های مورد آزمایش با نمودار استاندارد فعالیت لایزوزیم مرغی ترسیم شده مقایسه گردید، و میزان فعالیت لایزوزیم هر نمونه مشخص گردید.
پایان نامه - مقاله - پروژه
شکل۲-۷ اندازه گیری فعالیت لیزوزیم سرم
۲-۴-۲٫ بررسی قدرت باکتری کشی سرم (Kajita et al., 1990)
برای اندازه گیری قدرت باکتری کشی سرم از روش توصیه شده توسط Kajita و همکاران در سال ۱۹۹۰ با کمی تغییرات استفاده گردید. ابتدا باکتری آئروموناس هیدروفیلا به مدت ۴۸ ساعت در محیط [۲۵]TSB کشت داده شد و سپس سلولهای باکتریایی با سانتریفوژ ۳۰۰۰ دوردر دقیقه به مدت ۱۵ دقیقه جمع آوری وبا افزودن مقداری بافرفسفات سدیم استریل به آنها، جذب نوری سوسپانسیون حاصله در طول موج ۵۴۰ نانومتر برابر ۱ تنظیم گردید. تعداد باکتری در سوسپانسیون حاصل شمارش شده و با بهره گرفتن از روش تهیه رقت های متوالی بر مبنای ده، سوسپانسیون ۱۰۵ باکتری در میلی لیتر در ژلاتین ورونال بافر استریل (۵/۷ pH=) و حاوی ۵/۰ میلی مول در میلی لیتر یون کلسیم و ۱۵/۰ میلی مول در میلی لیتر یون منیزیم) تهیه گردید.
نمونه های سرمی به نسبت ۱:۳(بافر:سرم) با بافر فوق رقیق گردیدند. سوسپانسیون باکتریایی حاصل به نسبت ۱:۱ با سرم رقیق شده ترکیب شده و بمدت ۹۰ دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد با حرکت ملایم انکوبه گردیدند. سپس ۵ میکرولیتر از مخلوط سرم و باکتری در محیط کشت [۲۶]TSA در سه تکرار کشت داده شد. محیط های کشت به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد انکوبه گردیده و سپس به کمک دستگاه کلونی کانتر تعداد پرگنه باکتریایی رشد یافته در روی محیط کشت شمارش گردید. نتایج بصورت متوسط تعداد باکتری شمارش شده در هر سه تکرار برای هر نمونه گزارش گردید.
۲-۴-۳٫ اندازه گیری فعالیت کمپلمان((Selvaraj et al., 2005
سیستم کمپلمان در ماهیان بیشترین فعالیت را در دمای ۱۵ تا ۲۵ درجه سانتیگراد دارد ولی در دمای ۴تا۰ درجه سانتیگراد هم فعال است و در مقایسه با پستانداران که فعالیت اپتیمال آنها در دمای ۳۷ درجه است در تضاد می‌باشد. انعطاف پذیری فعالیت سیستم کمپلمان بعنوان عملیات ایمنی غیر اختصاصی، در این دامنه دمایی نشان دهنده نقش جبرانی سیستم کمپلمان، در مدت زمانی که ایمنی اختصاصی هنوز به راه نیافتاده و کند است، می‌باشد(شکل ۲-۸).
۲-۴-۴٫ اندازه گیری فعالیت همولیتیک عامل کمپلمان
فعالیت همولیتیک عامل مکمل به وسیله واحد شناخته شده ای با عنوان CH50 اندازه گیری می‌شود، که عبارت است از یک دوز از سرم (به عنوان منبع عامل مکمل)که قادر به لیز کردن ۵۰ درصد گلبول های قرمز حساس با آنتی بادی سرم ضد گلبول قرمز ماهی مورد نظر را تامین و با حرارت غیر فعال کرده و سپس با همان نوع گلبول قرمز مجاور می‌کند. در واقع CH50 عبارت است از همولیز با واسطه آنتی بادی که به وسیله فعال سازی مسیر کلاسیک تامین شده است. ACH50 یا SH50 یا همولیز خودبخودی، فعالیت لیز کنندگی است که بدون حضور آنتی بادی اختصاصی، در سرم (به عنوان منبع عامل مکمل) وجود دارد که این همولیز به واسطه فعال شدن مسیر فرعی توسط گلبول های قرمز هترولوگ ایجاد شده است (سلطانی، ۱۳۸۷).
۲-۴-۵٫ تست کمپلمان [۲۷](ACH50)
به هر ۵/۰ میکرولیتر سرم رقیق سازی شده در) EGTA-MG-GVB 10Mm ({بافر ورونال حاوی ۱۰ میلی مول اتیلن گلیکو تترا استیک اسید[۲۸]،۱۰ میلی مول دی کلرید منیزیم[۲۹] و ژلاتین ۰٫۱% }،مقدار ۲۰۰ میکرولیتر سوسپانسیون(۲٫۵×۱۰۸ cell ml-1) گلبول قرمز گوسفند در بافر ۱۰Mm EGTA-MG-GVB اضافه شد. رقت های تهیه شده در دمای C150 به مدت ۹۰ دقیقه انکوبه شدند. فعالیت همولیتیک با افزودن ۸/۲ میلی لیتر از بافر ۱۰ میلی مولار ای.دی. تی. ای -ژلاتین -ورونال بافر (۱۰mM EDTA-GVB) (بافر ورونال حاوی ۱۰ میلی مول اتیلن دی آمین تتر، استیک اسید[۳۰]و ژلاتین ۱/۰% )متوقف می‌شود. بعد از سانتریفوژ، مایع رویی در طول موج ۴۱۴ توسط اسپکتوفتومتر خوانده شد. درصد لیز(y) از تقسیم طول موج خوانده شده بر ۱۰۰ درصد لیز(لیز در آب مقطر) بدست آمد. گراف لوگاریتمی نقاط y/1-y و عکس رقت بر روی صفحه لگاریتمی[۳۱] رسم و سپس عکس رقتی که ۵۰ درصد همولیز را داشت ACH50(unit ml-1) از منحنی بدست آمده خوانده شد .(Matsuyama et al., 1988)
۲-۵٫ اندازه گیری پارامترهای خون­شناسی
برای اندازه گیری پارامترهای خون شناسی آبزیان با اصلاحاتی از همان روش های معمول و متداول برای اندازه گیری پارامترهای خون­شناسی پستانداران استفاده می‌گردد(et al., 2000 (Feldman.
۲-۵-۱٫ شمارش کلی گلبول های سفید (TWBC)[32]
شمارش کلی گلبول های سفید به روش مستقیم (هماسیتومتر) و همانند شمارش کلی گلبول های سفید پرندگان با رقیق کردن خون به نسبت ۱ به ۲۰۰ با محلول رقیق کننده نات – هریک صورت گرفت. برای این کار و پس از انتقال نمونه رقیق شده به لام هماسیتومتر تعداد گلبول های سفید در ۹ مربع بزرگ اولیه شمارش گردید و سپس تعداد کل گلبول های سفید در میلی متر مکعب خون با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه شد.(Thrall, 2004)
۲۰۰ (۱۰ درصد + تعداد کل گلبول های سفید شمارش شده در ۹ مربع بزرگ) = تعداد کل گلبول های سفید در میلی متر مکعب خون
۲-۵-۲٫ شمارش تفریقی گلبول های سفید
برای شمارش تفریقی گلبول های سفید( لنفوسیت ها, مونوسیت ها, نوتروفیل ها, بازوفیل ها و ائوزینوفیل ها) اقدام به تهیه گسترش خون گردید برای این کار و قبل از مخلوط نمودن نمونه خون با ماده ضد انعقاد مستقیماً یک قطره خون بر روی لام قرار گرفته و اقدام به تهیه گسترش گردید. گسترش های تهیه شده با الکل متیلیک تثبیت[۳۳] شده و سپس با بهره گرفتن از رنگ گیمسا به مدت ۲۰ دقیقه رنگ آمیزی شد و پس از پایان رنگ آمیزی و شستشوی لام و خشک شدن گسترش با عدسی ۱۰۰ و استفاده از روغن صدر تعداد یکصد سلول سفید مورد شمارش و درصد هر یک از سلول ها محاسبه و ثبت گردید(نظیفی، ۱۳۷۶).
۲-۶٫ عیار آنتی بادی
تعیین عیار آنتی بادی به عنوان یک آزمایش متداول در آزمایشگاههای تشخیصی مورد استفاده قرار می‌گیرد در این آزمایش میزان نسبی آنتی بادی موجود درسرم خون و هر گونه تغییر آن اندازه گیری گردید. نتایج بدست آمده در تشخیص تفریقی بین بیماری فعال و تماس قبلی با آنتی ژن مفید واقع می‌شود. نمونه سرم به طور سریال رقیق شده و با آنتی ژن مخلوط گردید. سرم آزمایش آنقدر رقیق شد که دیگر کمپلکس ایمنی تشکیل ندهد کمترین رقت، رقتی است که سرم بیمار در آن مثبت باشد. نتایج آزمایش معمولا به عنوان آخرین رقت مثبت گزارش می‌شود(Swain et al., 2006).
۲-۷٫ محاسبه میزان بقای نسبی RPS [۳۴]
بعد از پایان دوره ماهی های باقی مانده در هر تیمار به سه تکرار تقسیم شده و با باکتری زنده آئروموناس هیدروفیلا به میزان دو برابر دوز ایجاد کننده ۵۰% تلفات به روش داخل صفاقی، تزریق گردیدند. تعداد تلفات روزانه به مدت ۱۰ روز ثبت شده و در انتها ضمن محاسبه تلفات تجمعی هر تیمار، علاوه بر بررسی میزان مقاومت هر تیمار در برابر عفونت تجربی، میزان کارایی واکسن در تیمارهای واکسینه با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه گردید.
۱۰۰ (درصد تلفات ماهیان واکسینه نشده% درصد تلفات ماهیان واکسینه شده) - ۱ = درصد بقای نسبی
۲-۸٫ آزمون آماری
پس از اندازه گیری فاکتورهای مطرح شده و ثبت آنها ابتدا نرمال بودن داده و هموژنیتی انحراف معیارها با بهره گرفتن از آزمون کولموگراف اسمیرنف و تست Leven مورد بررسی قرار گرفت که در صورت نرمال بودن داده ها برای مقایسه بین تیمارهای آزمایشی از آزمون آنالیز واریانس یک طرفه( One way ANOVA) استفاده گردید. برای بررسی معنی دار بودن تفاوت میانگین تیمارها از تست تکمیلی دانکن در سطح اطمینان (P<0.05) استفاده شد. برای انجام آنالیز فوق از نرم افزار SPSS ویرایش ۱۶ استفاده گردید.
فصل سوم- نتایج
نتایج حاصل از مطالعات و آزمایشات صورت گرفته در دو گروه غیر ایمن و ایمن در این فصل و به شرح ذیل ارائه گردیده اند.
۳-۱٫ میزان لایزوزیم سرم
نتایج حاصل از آنالیز میزان لایزوزیم سرم در دو گروه ماهیان آزمایش ایمن شده و غیر ایمن شده به ترتیب در بخش های ۳-۱-۱ و ۳-۱-۲ ارائه شده اند.
۳-۱-۱٫ میزان لایزوزیم سرم در گروه ایمن شده
نتایج به دست آمده از میزان لایزوزیم سرم در گروه ماهیان آزمایش ایمن شده در انتهای دوره آزمایش در شکل ۳-۱ و جدول ۳-۱ ارائه شده است. نتایج حاصل از آنالیز واریانس یک طرفه تفاوت معنی داری را در میزان لایزوزیم سرم در گروه ایمن در تیمارهای مختلف نشان نداد(۰۵/۰P>).
همانطور که در نمودار مشاهده می‌گردد بیشترین میزان لایزوزیم سرم مربوط به ماهیان تغذیه شده با عصاره مرزه خوزستان(۹۴/۲۳± ۲۹۹)، کمترین میزان آن مربوط به ماهیان تغذیه شده با عصاره لعل کوهستان( ۶۲/۲۱ ± ۲۴۰) می‌باشد.
شکل ۳-۱ میانگین (M±SE) میزان لایزوزیم سرم در انتهای دوره در تیمارهای آزمایش ماهیان ایمن شده
۳-۱-۲٫ میزان لایزوزیم سرم در گروه غیر ایمن شده
نتایج حاصل از آنالیز میزان لایزوزیم سرم در گروه ماهیان آزمایش غیر ایمن شده در انتهای دوره آزمایش در شکل ۳-۲ و جدول ۳-۱ ارائه شده است. نتایج حاصل از آنالیز واریانس یک طرفه تفاوت معنی داری را در میزان فعالیت لایزوزیم سرم در گروه غیرایمن در تیمارهای مختلف نشان داد(۰۵/۰P<). همانطور که در نمودار و جدول مشخص است، در تیمار غیر ایمن تغذیه شده با جیره غذایی حاوی عصاره مرزه خوزستان افزایش در میزان فعالیت لایزوزیم مشاهده و بیشترین میزان فعالیت لایزوزیم سرم مربوط به ماهیان این تیمار می‌باشد(۴۰/۹±۲۹۴) و کمترین میزان آن مربوط به ماهیان تغذیه شده با عصاره لعل کوهستان(۸۷/۲۱±۲۱۳) می‌باشد.
شکل ۳-۲ میانگین (M±SE) میزان لایزوزیم سرم در انتهای دوره در تیمارهای آزمایش ماهیان غیر ایمن شده (*نتایج تیمارها با علامت مشابه فاقد اختلاف معنی داری می‌باشند)
جدول ۳-۱ میانگین و انحراف معیار پارامترهای مورد مطالعه

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...