فصل اول
مقدمه
فصل اول
مقدمه
۱-۱ بیان مساله
محصولات غذایی سرخ شده با وجود محتوای چربی بالای خود که باعث افزایش کلسترول خون، افزایش فشار خون و بیماری­های مربوط به انسداد شریان­های قلب می­شوند، هنوز مورد توجه مصرف کنندگان هستند (کستر^[۱] و همکاران، ۱۹۸۶). همچنین چربی­ها در سلول­ها نقش مهمی به عنوان ترکیبات ساختاری ایفا می­ کنند (رجایی^[۲] و همکاران، ۲۰۰۵).
تغییرات اکسیداتیو علاوه بر اثرات نامطلوب در سیستم­های بیولوژیک، مسئول ایجاد طعم و پایین آمدن کیفیت غذا و فساد مواد غذایی است (کانگ^[۳] و همکاران، ۲۰۰۶). مثلاً یکی از مهم­ترین مشکلات صنعت گوشت، اکسیداسیون چربی گوشت مخصوصاً در زمان نگهداری می­باشد. اکسیداسیون چربی در طول زمان نگهداری باعث بد طعم شدن گوشت، و اکسیداسیون میوگلوبین، باعث تغییر رنگ آن درحین نگهداری می­ شود (گرای^[۴] و همکاران، ۱۹۹۶).
آنتی اکسیدان­ها از طرفی باعث کاهش خطر ابتلاء به بیماری­های قلبی، عروقی و سکته می­شوند و از سوی دیگر از آسیب به DNA و ایجاد سرطان جلوگیری می­ کنند (نوگوچی و نیکی^[۵]، ۲۰۰۰). با وجود آنتی اکسیدان­های مختلف در پلاسما، سیستم دفاعی بدن به تنهایی قادر به از بین بردن رادیکال­های آزاد ایجاد شده در بدن نیست، به همین جهت نیاز به تأمین آنتی­اکسیدان از منابع خارجی وجود دارد که از طریق مواد غذایی تأ­مین می­ شود (یانگ و وودسایت^[۶]، ۲۰۰۱).
اگرچه ضد­اکسیدان­های صنعتی طی زمان طولانی برای جلوگیری از اکسیداسیون به موادغذایی اضافه می­شوند، اما به علت خاصیت سرطان­زایی بعضی از این افزودنی­ها (نیتو^[۷] و همکاران، ۲۰۱۰)، و آسیب­های کبدی ناشی از مصرف BHT و BHA(کریشنایا^[۸] و همکاران، ۲۰۰۷)، افزودن آن­ها به موادغذایی محدود و بعضاً ممنوع شده است (نیتو و همکاران، ۲۰۱۰).

امروزه نیاز به آنتی­اکسیدان­های قوی با سمیت کمتر و اثر بخشی بیشتر یک ضرورت اجتناب ناپذیر است. متخصصین تغذیه برای تأمین آنتی­اکسیدان­های مورد نیاز بدن، مصرف گیاهان، میوه­جات و سبزیجات را توصیه می­ کنند زیرا آنتی­اکسیدان­های گیاهی عوارض جانبی کمتر و خواص درمانی بهتری دارند (متئو و آبراهام^[۹]، ۲۰۰۶).
از سوی دیگر بروز مقاومت دارویی در انواع میکروارگانیسم­های بیماری­زا از یک سو و اثرات مضر نگهدارنده­های غذایی شیمیایی و سنتزی از سوی دیگر به عنوان یک چالش مهم در هر دو زمینه بهداشت و درمان انسان و دام تبدیل گردیده است. بنابراین یک نیاز مستمر در زمینه شناسایی ترکیبات ضد­میکروبی جدید جهت به حداقل رسانیدن مقاومت دارویی میکروارگانیسم­ها و استفاده از آن­ها به عنوان جایگزین نگهدارنده­های شیمیایی احساس می­ شود (گراگ^[۱۰] و همکاران، ۱۹۹۷). امروزه با اینکه بخش عظیمی از دارو­های مصرفی شیمیایی هستند اما برآورد می­ شود دست کم یک سوم کلیه فرآورده ­های دارویی منشأ گیاهی دارند یا پس از استخراج از گیاه تغییر شکل یافته­اند (بشارت^[۱۱] و همکاران، ۲۰۰۹).
متابولیت­های ثانویه مشتق شده از گیاهان مانند فنل و فلاوونوئید دارای پتانسیل قوی برای پاک­سازی رادیکال­های آزاد می­باشند که در تمام قسمت­ های گیاه مانند برگ، میوه، دانه و ریشه وجود دارند (متئو و آبراهام، ۲۰۰۶). به طور مثال ماروبیوم ولوتینوم^[۱۲] دارای درصد بالایی از ترکیبات حفاظت کننده و ضد­اکسایشی نظیر فلاوونوئید­ها می­باشد (کاریوتی^[۱۳] و همکاران ، ۲۰۰۳)، که خود می ­تواند در کاهش استرس اکسیداتیو ناشی از اثر رادیکال­های آزاد اکسیژن که در بیماری رایج دیابت به علت افزایش سطح گلوگز خون اتفاق می­افتد، مؤثر واقع شود (کوکاک^[۱۴] و همکاران ۲۰۰۰). همچنین دارچین به عنوان ادویه غذایی کاربرد زیادی دارد و مطالعات نشان می­دهد که بی اثر کننده خوبی برای رادیکال سوپراکسید می­باشد (مورشیا و همکاران ۲۰۰۴). در مطالعه­ ای دیگر اسانس پونه کوهی به روغن آفتابگردان افزوده شد و روند اکسیداسیون را مهار نمود (اولمدو^[۱۵] و همکاران ۲۰۱۴). همچنین ارزیابی خواص ضد­میکروبی و ضد­اکسایشی اسانس گیاهان کرفس­، ریحان و گشنیز در کشور پرتغال، حاکی از تأثیر فوق العاده بالای آن­ها در حفاظت اکسایشی و میکروبی (به ویژه میکروبی) بوده است و می­توانند در صنایع آرایشی و بهداشتی، دارویی و غذایی در جهت کاهش نگرانی ناشی از به خطر افتادن سلامت مصرف کننده، جایگزین مواد مصنوعی گردند (جورج و همکاران ، ۲۰۱۳). به همین علت استفاده از ترکیبات طبیعی به جای افزودنی­های سنتزی، رواج پیدا کرده است. مثلاً اسانس آویشن حاوی بیش از ۱۰ ماده می­باشد که دارای خواص مفیدی از جمله، ضد­عفونی­کننده، ضد­­­نفخ، ضد­اکسیدانی و ضد­­میکروبی است (بوزین^[۱۶] و همکاران، ۲۰۰۶). همچنین پلی­ساکارید استخراج شده از برگ گیاهانی چون پاریس پلیفیلا^[۱۷] در شرایط آزمایشگاهی خاصیت ضد­­اکسیدانی بالایی نشان داد (شین^[۱۸] و همکاران، ۲۰۱۴). پلی ساکارید محلول در آب استخراج شده از کدوتنبل، بوسیله سلولاز فعالیت ضد­میکروبی زیادی نشان داده است (جیان^[۱۹]، ۲۰۱۴). همچنین خاصیت ضد­میکروبی پلی­ساکارید محلول در آب گیاه تراکساکوم افیسینال^[۲۰] بر باسیلوس سوبتیلیس، استافیلوکوکوس­اورئوس و اشرشیا­کلی مورد بررسی قرار گرفت و نتایج نشان داد که دارای فعالیت ضد­باکتریایی بالایی بوده و می ­تواند به عنوان یک ماده نگهدارنده در مواد غذایی مورد توجه قرار گیرد (وانگ^[۲۱]، ۲۰۱۴). مطالعات موجود نشان می­ دهند که بسیاری از پلی­ساکارید­های استخراج شده از گیاهان، به طور قطع دارای خواص ضد­­اکسیدانی هستند و توان مهار رادیکال­های
آزاد را دارند و می­توانند به عنوان پتانسیل­های جدید در زمینه آنتی­­­اکسیدانی استفاده شوند (جیان و همکاران، ۲۰۱۳).
۱-۲ ضرورت و اهمیت اجرای طرح
با توجه به اثبات خواص ضد­میکروبی و ضد­اکسیدانی پلی­ساکارید پاره­ای از گیاهان دارویی و همچنین به دلیل اینکه گیاه هفت­کول با وجود دارا بودن خواص درمانی، موضوع تحقیقات نبوده و مورد بررسی قرار نگرفته است، مبنای این پژوهش، بهینه­سازی شرایط استخراج پلی­ساکارید گیاه هفت­کول، شناسایی ساختار آن و بررسی خواص ضد­اکسایشی و ضد­میکروبی آن قرار گرفته است.
۱-۲-۱ گیاه هفت­کول و محل رویش آن
هفت­کول از رده دیپساکال­ها و جنس ویبورنوم بوده و دارای نام علمیViburnum lantana L. می­باشد. در مازندران (آمل و لاهیجان) با نام­ هفت­کول، در نور و کجور با نام مخرا، در ارسباران، گرمه­شو، در زیارت، زنیدار، در درفک، پلاخور، در آذربایجان غربی، آغاجی و در مناطق کرد نشین آذربایجان با نام ته­تهو شناخته می­ شود (میرحیدر، ۱۳۸۲).
گیاه هفت­کول درختچه­ای است به ارتفاع ۲-۱ متر، که در آناتولی، قفقاز و شمال ایران یافت می­ شود (زرگری، ۱۳۷۱) و در ایران در حد فوقانی جنگل­های شمال، در ارتفاعات ۲۰۰۰ تا ۳۰۰۰ متری (میر­حیدر، ۱۳۸۲)، در جنگل­های نواحی شمال تا پل زنگوله (در ارتفاعات ۲۶۰۰ متری)، کوه شاهوار نزدیک حاجی­لنگ در ارتفاعات ۲۴۰۰ تا ۲۶۰۰ متری (گرگان)، دره چالوس در ارتفاعات ۲۴۰۰ متری، دره هراز، کوه­های نزدیک تنکابن (گیلان)، قره داغ نزدیک حسن بیگلو و کلیبر (آذربایجان) می­روید (زرگری، ۱۳۶۸).
۱-۲-۲ خواص درمانی هفت­کول
در استعمال خارجی از جوشانده هفت­کول به صورت غرغره در رفع آنژین­های ساده و ورم لثه استفاده می­ کنند. در ضمن پزشکان در گذشته عقیده داشتند که برای ترمیم لثه­های فرسایش یافته می­توان از جوشانده آن بهره گرفت (زرگری، ۱۳۷۱). میوه گیاه هفت­کول در درمان دیابت و اسهال استفاده شده و به صورت جوشانده و یا عصاره­گیری از آن، مورد مصرف قرار می­گیرد (آلتونداگ و ازترک^[۲۲]، ۲۰۱۱). با توجه به پراکندگی جغرافیایی این گونه در ارتفاعات و شناخت کم اطباء سنتی از آن، به نظر می­رسد در پزشکی سنتی ایران جایگاه لازم را نیافته است و برای آشنایی واقعی با ارزش­های دارویی آن نیازمند تحقیق و تفحص بیشتر می­باشیم (مظفریان، ۱۳۹۱).

شکل ۱-۱ گیاه هفت کول (ویبورنوم لانتانا)
۱-۳ اهداف
۱-۳-۱ اهداف اصلی
هدف از این مطالعه تعیین شرایط بهینه استخراج پلی­ساکارید برگ گیاه هفت­کول و بررسی خواص ضد­­اکسیدانی و ضد­میکروبی آن می­باشد.
۱-۳-۲ اهداف فرعی

1. 1. تعیین غلظتی از پلی­ساکارید که بهترین عملکرد ضد­اکسیدانی را خواهد داشت.

1. 1. تعیین غلظتی از پلی­ساکارید که بهترین عملکرد ضد­میکروبی را خواهد داشت.

1. 1. شناسایی ساختار پلی­ساکارید استخراج شده از گیاه هفت­کول.

فصل دوم
کلیات و مروری بر پژوهش­های انجام شده
فصل دوم
کلیات و مروری بر پژوهش­های انجام شده
۲-۱ مقدمه
واکنش­های بیوشیمیایی که در سلول­های بدن ما رخ می­ دهند عامل ادامه حیات هستند، قانونی که طبیعت از کودکی به بدن ما دیکته می­ کند و ما را به سوی بزرگسالی، کهنسالی و نهایتاً مرگ می­کشاند. از آنجا که تعداد تولد­ها به شدت کاهش یافته، در آینده­ای نزدیک، جهان شاهد جمعیت بزرگی از سالخوردگان خواهد بود. این مرحله از زندگی با بیماری­های قلبی-عروقی، مغز و سیستم ایمنی همراه است که هزینه­ های درمانی و اجتماعی بالایی را می­طلبد (کرکو و فریرا^[۲۳]، ۲۰۱۳). از این رو کنترل گسترش این بیماری­های مزمن به منظور کاهش درد و رنج افراد مسن و همچنین کاهش هزینه­ های درمانی حائز اهمیت است (کرکو و فریرا، ۲۰۱۳).
انسان­ها به منظور ادامه حیات خود از مواد غذایی مختلفی به عنوان منبعی برای کسب انرژی استفاده می­ کنند. از این جهت به منظور حفظ سلامت مصرف کنندگان باید عوامل آلوده کننده مواد غذایی و تهدید کننده سلامت مصرف کنندگان حذف گردیده و از آلودگی مجدد آن جلوگیری شود.
از این رو به هرگونه تغییر در ماده غذایی که منجر به عدم پذیرش ماده مورد نظر توسط مصرف کننده گردد فساد گفته می­ شود. این تغییرات در اثر صدمات فیزیکی، شیمیایی (اکسیداسیون، تغییر رنگ و…) و یا تغییرات ناشی از فعالیت و رشد میکروارگانیسم­ها در مواد غذایی ایجاد می­شوند (گرام^[۲۴] و همکاران، ۲۰۰۲).
غذاهای حاوی میزان بالای ترکیبات اسید چرب غیر اشباع، بسیار مستعد اکسیداسیون هستند، اکسیداسیون
چربی­ها در ماده غذایی منجر به کاهش ارزش غذایی می­گردد (کانگ^[۲۵] و همکاران، ۲۰۰۶). و علاوه بر آن، مستعد بودن چربی به اکسیداسیون یکی از مهم ترین دلایل پیدایش بوی تعفن، طعم نامطلوب و تغییرات رنگ در محصولات غذایی است.
رادیکال­های آزاد، آنتی­اکسیدان­ها و کو­فاکتورها، سه عامل مهم و تاثیرگذار بر روند پیری و واکنش­های اکسایشی می­باشند، در نتیجه شناخت این واکنش­ها در بدن انسان می ­تواند به پیشگیری یا کاهش این بیماری­ها کمک کرده و باعث بهبود کیفیت زندگی شود (کرکو و فریرا، ۲۰۱۳).
از سویی دیگر امروزه با افزایش استفاده از آنتی بیوتیک­های رایج درمانی و دارو­های ضد­میکروبی شاهد شیوع و گسترش روز افزون گونه­ های میکروبی بیماری­زای مقاوم به آنتی بیوتیک­ها هستیم. بیماری­های عفونی از جمله بیماری­های گسترده و شایع در جهان هستند که هزینه­ های فراوانی را به جوامع بشری تحمیل می­ کنند. هرچند مصرف آنتی­بیوتیک­های سنتزی در دهه­های گذشته توانسته در درمان بیماری­های عفونی نقش مهمی را ایفا نماید، اما مشکل عمده این مواد، ایجاد مقاومت میکروبی، قیمت بالای این مواد و مشکلات زیست محیطی آنتی­بیوتیک­ها در فرد مصرف کننده می­باشد که موجب شده است، امروزه بیش از پیش تمایل به مصرف مواد جایگزینی که ضرر کمتری دارند افزایش یابد (دوکا^[۲۶] و همکاران، ۲۰۰۷).
۲-۲ واکنش­های اکسیداسیون و احیاء
۲-۲-۱ تعادل اکسیداسیون- احیاء درون سلولی
تعادل اکسیداسیون- احیاء در درون سلول نتیجه یک موازنه دینامیک میان مولکول­های اکسیدان و آنتی­اکسیدان می­باشد. استرس ناشی از اکسیدان­ها زمانی اتفاق می­افتد که محصولات حاصل از اکسیداسیون، احیا از ظرفیت دفاعی-آنتی­اکسیدانی سلول، تجاوز کند. اکسیداسیون بیش از حد می ­تواند باعث آسیب اکسیداتیو ماکرومولکول­ها، پراکسیداسیون لیپید­ها، اکسیداسیون زنجیره­های جانبی اسید­آمینه و پلی­پپتید­ها شده و در نتیجه تکه­ تکه شدن پروتئین و آسیب DNA را در­پیش داشته باشد (ژانگ^[۲۷] و همکاران، ۲۰۱۴).
در صورت واکنش رادیکال­های آزاد با ترکیبات وابسته به اکسیژن، مانند سوپراکسید، هیدروکسیل و هیدروژن پراکسید که در طول سوخت و ساز در بدن تولید می­شوند، می­توانند باعث آسیب رساندن به اسید­های چرب، پروتئین­ها، DNA و دیگر ماکرومولکول­ها در بدن شوند که نتیجه آن بروز بیماری­های مختلف از جمله بیماری­های قلبی و عروقی، بیماری­های عصبی و سرطان می­باشد (کریشنایا و همکاران، ۲۰۰۷).
۲-۲-۲ رادیکال­های آزاد
رادیکال­های آزاد، اتم­ها، مولکول­ها و یون­هایی هستند که دارای الکترون جفت نشده بوده و بسیار ناپایدار هستند و تمایل زیادی به واکنش با مولکول­های دیگر دارند. سه عنصر مهمی که در ساختار رادیکال­های آزاد شرکت دارند، اکسیژن، نیتروژن و گوگرد هستند. ترکیبات دارای این عناصر به ترتیب به صورت ROS، RNS و RSS نشان داده می­شوند.
ROS شامل رادیکال­های آزادی چون سوپراکسید آنیونی (O₂^-.)، رادیکال هیدروکسیل (OH^.) و گونه­ های دیگری چون پراکسید­هیدروژن (H₂O₂) و اکسیژن یگانه (^.O₂) می­باشند.
RNS از NO مشتق شده، با O₂^-. واکنش داده و ONOO^- تشکیل می­ شود. RSS­ها به راحتی بوسیله واکنش ROS با تیول­ها تشکیل می­شوند (لو^[۲۸] و همکاران، ۲۰۱۰؛ کرکو و فریرا، ۲۰۱۳).
در درون بدن، رادیکال­های آزاد به عنوان یک جزء طبیعی از متابولیسم در میتوکندری و از طریق زانتین اکسیداز، فرایند­های التهاب، فاگوسیتوز، کم خونی موقت، فعالیت­های ورزشی و… تولید می­شوند اما عوامل خارجی که باعث گسترش تولید رادیکال­های آزاد می­شوند، سیگار کشیدن، آلاینده­های صنعتی، اشعه، مواد مخدر، آفت­کش­ها و ازن می­باشند. جالب این است که این عناصر و به ویژه اکسیژن، در حالی­که برای حیات ضروری هستند، در این واکنش­ها اثرات مضری بر بدن انسان خواهند داشت (کرکو و فریرا، ۲۰۱۳). برقراری تعادل بین تولید و خنثی شدن ROS بوسیله آنتی­اکسیدان­ها، حائز اهمیت بسیار است و زمانی­که این تعادل به سمت تولید ROS بیشتر برهم بخورد، آسیب سلولی ناشی از استرس اکسیداتیو آغاز می­گردد (کرکو و فریرا، ۲۰۱۳).
تخمین زده می­ شود که یک سلول انسان در طول یک روز، بوسیله رادیکال هیدوکسیل و دیگر گونه­ های رادیکال آزاد، به طور متوسط ۱۰^۵ بار هدف قرار گرفته و متحمل استرس می­ شود (کرکو و فریرا، ۲۰۱۳). اهداف اصلی رادیکال­های آزاد، پروتئین­ها، اسیدهای نوکلئیک، قند­ها و چربی­ها هستند (کرافت^[۲۹] و همکاران، ۲۰۱۲) (کرکو و فریرا، ۲۰۱۳).
۲-۲-۲-۱ رادیکال هیدروکسیل
فرایند­های اکسیداسیون پیشرفته، همواره منجر به تولید رادیکال­های بسیار فعال هیدروکسیل می­گردند که این رادیکال­ها، پتانسیل بالایی برای اکسیداسیون ترکیبات آلی دارند. یکی از فرایند­­های اکسیداسیون شیمیایی، فنتون است که در آن، یون آهن به عنوان کاتالیزور در یک محیط اسیدی با اکسیدان وارد واکنش شده و تولید رادیکال هیدروکسیل می­نماید. این واکنش از نوع واکنش­های اکسایش-احیا می­باشد، به این ترتیب که یون فلزی، انتقال یک الکترون را می­پذیرد (توماس^[۳۰] و همکاران، ۲۰۰۹). این واکنش شامل احیاء (کاهش) H₂O₂ با آهن (II) می­باشد، اما می ­تواند در حضور مس نیز رخ دهد. نیمه عمر رادیکال هیدروکسیل بسیار کوتاه است (^۹-۱۰ ثانیه) و این موضوع باعث شده روش­های شناسایی آن محدود و غیر مستقیم گردد مانند روش­های الکتروشیمیایی، فلوریمتری و اسپکتروفوتومتری (میر^[۳۱] و همکاران، ۲۰۱۴).