a
abc
نمودار ۳-۱- مقایسه مراحل سلولی مختلف جنینی (درصد جنین ها) در موش سوری از نظر مورفولوژی نرمال(p<0/05)
از نظر آماری اختلاف معنی داری بین گروه های ۲ سلولی، ۴ سلولی و۸ سلولی با زیگوت مشاهده شد، همچنین اختلاف معنی داری بین گروه مورولا با گروه های زیگوت، ۲ سلولی و ۴ سلولی مشاهده گردید.
a
a
abc
a
نمودار ۳-۲- مقایسه مراحل سلولی مختلف جنینی (درصد جنین ها) در موش سوری از نظرلیز شدن (p<0/05)
از نظر آماری اختلاف معنی داری بین گروه های ۲ سلولی، ۴ سلولی و۸ سلولی با زیگوت مشاهده شد، همچنین اختلاف معنی داری بین گروه مورولا با گروه های زیگوت، ۲ سلولی و ۴ سلولی مشاهده گردید.
ab
ab
ab
نمودار ۳-۳- مقایسه مراحل سلولی مختلف جنینی (درصد جنین ها) در موش سوری از نظرکلیواژ (p<0/05)
از نظر آماری گروه های ۴ سلولی، ۸ سلولی و مورولا از لحاظ شکافتگی اختلاف معنی دار با گروه های زیگوت و ۲سلولی، نشان می دهند.
abcd
ab
ab
نمودار ۳-۴- مقایسه مراحل سلولی مختلف جنینی (درصد جنین ها) در موش سوری از نظررسیدن به مرحله بلاستوسیست (p<0/05)
از نظر آماری اختلاف معنی داری بین گروه های ۴ سلولی و ۸ سلولی با گروه های زیگوت و ۲سلولی مشاهده شد، و همچنین اختلاف معنی دار بین گروه مورولا با گروه های زیگوت، ۲ سلولی، ۴ سلولی و ۸ سلولی نشان داده شده است.
abcd
ab
ab
نمودار ۳-۵- مقایسه مراحل سلولی مختلف جنینی (درصد جنین ها) در موش سوری از نظر متوقف شدن (p<0/05)
از نظر آماری اختلاف معنی داری بین گروه های ۴ سلولی و ۸ سلولی با گروه های زیگوت و ۲سلولی نشان داده شده است، و همچنین اختلاف معنی دار بین گروه مورولا با گروه های زیگوت، ۲ سلولی، ۴ سلولی و ۸ سلولی نشان داده شده است.
a
a
a
ab
نمودار ۳-۶- مقایسه مراحل سلولی مختلف جنینی (درصد جنین ها) در موش سوری از نظر متوقف شدن از نوع ۱(p<0/05)
از لحاظ آماری درصدی ازگروههای ۲ سلولی، ۸ سلولی و مورولای متوقف شده مربوط به تیپ یک، اختلاف معنی داری را با گروه زیگوت نشان دادند، همچنین گروه ۴ سلولی دارای اختلاف معنی دار با گروه های زیگوت و ۲ سلولی بود.
a
نمودار ۳-۷- مقایسه مراحل سلولی مختلف جنینی (درصد جنین ها) در موش سوری از نظر متوقف شدن از نوع ۲ (p<0/05)
از نظر آماری در این مرحله تنها درصدی از جنین های مرحله دو سلولی که دچار توقف تیپ ۲ شده بودند اختلاف معنی دار با گروه زیگوت را نشان دادند.
b
ab
نمودار ۳-۷- مقایسه مراحل سلولی مختلف جنینی (درصد جنین ها) در موش سوری از نظر متوقف شدن از نوع ۳ (p<0/05)
از نظر آماری درصدی از جنین های مرحله ۴ سلولی که دچار توقف تیپ ۳ شده بودند اختلاف معنی دار با گروه های زیگوت و ۲ سلولی را نشان دادند و همچنین گروه ۸ سلولی نیز دارای اختلاف معنی دار با گروه ۲ سلولی بود.
فصل چهارم
بحث
۴- بحث
حفاظت انجمادی تخمک ها و جنین ها تکنولوژی مهمی در حفظ باروری، ذخیره ژنتیکی تخمک و جنین پستانداران و نگهداری آنها به منظور استفاده در فرایند شبیه سازی می باشد .(Fujiwara et al., 2010)با وجود اهمیت این فرایند و پیشرفت های اخیر کفایت انجماد تخمک و جنین پستانداران هنوز پایین می باشد. لذا تلاش های زیادی با بهره گرفتن از پروتکل های مختلف در جهت انجماد تخمک و جنین گونه های مختلف صورت گرفته است که در این روش ها رسیدن تخمک ها و جنین های انجمادی به مرحله بلاستوسیست یکی از معیارهای موفق این پروتکل ها می باشد. بنابراین برای استفاده بهینه از تخمک ها و جنین های انجمادی در زمینه بیولوژی تولید مثل استفاده از روش های انجماد موفق ضروری است.(Succu et al., 2008) در این راستا این مطالعه به بررسی روش انجمادی و مقایسه میزان تکوین و میزان کلیواژ و پیشرفت رشد تا مرحله بلاستولا در جنین های منجمد- ذوب شده موش سوری در مراحل زیگوت، دو سلولی، چهار سلولی، هشت سلولی و مورولا می پردازد. لازم به ذکر است که انتخاب نوع روش انجماد شیشه ای، حساسیت جنین ها به فرایند انجماد شیشه ای، لقاح آزمایشگاهی و همچنین مراحل مختلف رشد جنینی می تواند بر نتایج حاصل از انجماد- ذوب جنین ها در مراحل مختلف رشد سلولی موثر باشد که به شرح آنها پرداخته می شود.

۴-۱- انجماد شیشه ای^[۱۰۵]
با توجه به کاستی هایی که در روش انجماد کند وجود دارد عده ای از محققین تلاش کردند تا این مشکلات را برطرف کنند. تحقیقاتی که برای پیدا کردن روش دیگری که بتواند در زمان کوتاه تر و با حذف مراحل متعدد جنین را منجمد کند نهایتا به ابداع روشی از سوی Rall در سال ۱۹۸۵ منجر شد. که این روش انجماد شیشه ای نامیده می شد (Rall, 1985).
انجماد شیشه ای یک روش جدیدی است که در آن از تشکیل یخ خارج سلولی و داخل سلولی جلوگیری می شود و یک وضعیت شبیه به شیشه ایجاد می شود. در دماهای پایین محلولها بسیار غلیظ می شوند و یک حالت جامد بدون اینکه بلور یخ تشکیل شود ایجاد می شود این حالت در اثر دهیدراسیون و افزایش بسیار زیاد در غلظت رخ می دهد که سرعت های بسیار زیاد انجماد از ºC/min 30000-15000 عامل آن است.
Fahy در سال ۱۹۸۴ در مقاله ای با توصیف انجماد شیشه ای و عوامل موثر در آن پیشنهاد کرد که این روش بتواند برای نگهداری سلولها و اعضاء بکار گرفته شود. وی می گوید، به کمک انجماد شیشه ای در جریان انجماد جنبش ملکولها متوقف شده و ساعت بیولوژیک از کار می افتد در حالی که آندسته از تغییراتی که در جریان انجماد کند در سلولها رخ می دهد پیش نمی آید. Rall وهمکارش Fahy برای انجماد جنین ۸ سلولی موش از روش انجماد شیشه ای استفاده کردند. آنها جنین موش را در حضور مخلوطی از مواد محافظ انجمادی شامل۵/۲۰ درصد W/V دی متیل سولفوکساید، ۵/۱۵ درصد استامید، ۱۰ درصد پروپیلن گلایکول و ۶ درصد پلی اتیلن گلیکول که تحت عنوان VS نامیده شده بود، با سرعتهای ۲۰، ۵۰۰و۲۵۰۰ درجه در دقیقه سرد و با سرعتهای۱۰،۳۰۰ و ۲۵۰۰ درجه در دقیقه ذوب کردند. بالاترین میزان رشد در حالتی بوجود آمد که جنین ها را با سرعت ۲۵۰۰ منجمد و ذوب کرده بودند. آزمایشات Rall نشان داد در صورتی که مقدار مواد ضد یخ در محیط افزایش یابد(<40% حجم محلول) آب داخل و خارج سلول در جریان انجماد به بلورهای یخ تبدیل نمی شوند بلکه در عوض بدون افزایش حجم به ماده­ای غلیظ و سرد تبدیل می شوند و در نتیجه به سلول آسیب نمی رسانند. همین محقق با همکارانش در سال ۱۹۸۷ در مقاله ای اصول حاکم بر انجماد شیشه ای را بررسی کرد و با مرور مطالعات گذشته اظهار کرد که از این روش می توان در انجماد سلولها و برخی از بافتها استفاده کرد. در حقیقت در این روش با جلوگیری از تشکیل بلورهای یخ متعاقب افزایش غلظت مواد موجود در جنین و محلولی که جنین در آن قرار گرفته از بروز صدمات وارده به دنبال تشکیل بلورهای یخ جلوگیری می شود.
در تحقیق حاضر، اتیلن گلیکول ۱۰درصد و ۲۰درصد و دی متیل سولفوکساید ۱۰ درصد و ۲۰درصد (به ترتیب برای VS1 و VS2) استفاده شده است که مشابه مواد استفاده شده در تحقیق Rall و Fahy می باشد با این تفاوت که در این تحقیق از سایر مواد استفاده شده در تحقیقات Rall و Fahy استفاده نشده است و قند به کار رفته در این تحقیق سوکروز می باشد.
ولی تحقیقات بعدی توسط Massip و همکارانش (Massip et al., 1986)ضمن معرفی محلول جدیدی برای روش انجماد شیشه ­ای نشان داد که حضور تمام مواد پیشنهاد شده توسط Rall برای انجماد شیشه ای ضرورت ندارد، محلول ضد یخی که Massip و همکارانش استفاده کردند مخلوطی از ۴/۳ مول گلیسرول، ۴/۳ مول پروپیلن گلیکول بود به علاوه از ماده ای مانند استامید استفاده نشده بود و غلظت ضد یخ نفوذ ناپذیر (ماکروملکول) نیز در آن بشدت کاهش یافته بود (حدود ۳/۰ درصد) وی گزارش کرد که این محلول برای حفاظت جنین گاو و موش در مرحله مورولا و بلاستوسیست قابلیت خوبی داشته است. هر چند که این محلول برای نگهداری بلاستوسیست ها به خوبی مورولا نبوده است .
در این تحقیق تعداد مواد استفاده شده مشابه با تحقیقات Massip و همکارانش و مخالف با تحقیقات Rall و Fahy می باشد و نتایج به دست آمده همانند نتایج حاصل از کار Massip و همکارانش بوده که مورولا بهترین نتیجه و بالاترین درصد زنده ماندن را در مقایسه با سایر مراحل رشد داشته است.
Rall و همکارانش در گزارشی به سال ۱۹۸۷ با بهره گرفتن از همان مخلوط ضد یخی که در اولین گزارش خود بکار برده بودند آزمایش دیگری را طراحی کردند. بدین صورت که محلول ضد یخ را بطور تدریجی از ۲۵ درصد تا ۱۰۰ درصد وارد محیط جنین ها کردند و سپس جنین ها را مستقیما در نیتروژن مایع قرار دادند(ºC~ 2500 در دقیقه) و در مرحله بعد جنین های منجمد را با تکان دادن در آب ۲ درجه سانتی گراد ذوب کردند و ضد یخ را بصورت نزولی از محیط خارج کردند و تعدادی از جنین ها را نیز تنها در محلولهای ضد یخ قرار دادند و بدون منجمد کردن مجدد، ضد یخ را از محیط خارج کردند. آزمایشات آنها نشان داد که اولا جنین هایی که وارد نیتروژن نشده بودند درصد زنده و رشد بهتری داشتند ثانیا جنین هایی که مستقیما در محلول صد در صد ضد یخ قرار داده شده بودند درصد رشد پایین تری داشتند. آنها همچنین با قرار دادن جنین های منجمد-ذوب شده در رحم موشهای همان نژاد توانستند تعدادی نوزاد موش بدنیا آورند و بدین ترتیب نشان دادند که روش انجماد شیشه ­ای می تواند نتایج قابل قبولی داشته باشد و در صورت انتقال جنین به مادر به تولد نوزاد منجر شود.