ب) W2:HM supplemented with 0/62M sucrose.
ج) W3: HM supplemented with 0/31M sucrose.
د) Holding medium(HM): Wash in HM
تخمکهایی که روی کرایوتاپ فریز شده را سریع از مایع ازت برداشته و در محیط W1 حدود یک دقیقه قرار داده و بعد به محیط W2 انتقال داده و در این محیط ۳۰ ثانیه میماند و بعد به محیط W3 انتقال داده و در این محیط نیز ۳۰ ثانیه میماند و در نهایت به محیط HM انتقال داده میشود و در آخر که همه تخمکها در محیط HM جمع آوری شدند را حدود ۳ با در این محیط شستشو داده و وارد محیط IVM میگردد و در این محیط ۲۴ ساعت میماند.
۳-۵- گروه های آزمایش و طراحی مطالعه
در این مطالعه تخمک ها به دو دسته کلی ۱- تخمک های منجمد- ذوب شده و ۲- تخمک های منجمد نشده تقسیم گردیدند که هریک از این دو دسته نیز دارای گروه هایی می باشند که توضیح آن در زیر آورده شده است:
۱- تخمک های منجمد
گروه آزمایشی اول: در این گروه تخمکها در مرحله GV منجمد شده و پس از ذوب به محیط بلوغ آزمایشگاهی که دارای ng1000 آلدوسترون میباشد منتقل گردیده (و به مدت ۲۲ ساعت در این محیط باقی می ماند) و سپس مراحل لقاح و کشت در شرایط آزمایشگاهی را طی می کنند.
گروه آزمایشی دوم: در این گروه تخمک ها در مرحله GV منجمد شده و پس از ذوب و طی مرحله لقاح آزمایشگاهی، در روز چهارم کشت جنینی، ng1000 آلدوسترون به محیط کشت افزوده شده و به مدت ۲۲ ساعت در محیط باقی می مانند.
گروه آزمایشی سوم: در این گروه تخمک ها قبل از انجماد، به محیط بلوغ حاوی ng1000 آلدوسترون منتقل گردیده و پس از گذشت ۲۲ ساعت، تخمک های مذکور در مرحله MII منجمد می گردند. تخمک های منجمد شده، پس از ذوب، مراحل لقاح و کشت در شرایط آزمایشگاهی را طی می کنند.
گروه آزمایشی چهارم: در این گروه تخمک ها بدون این که آلدوسترونی دریافت نمایند، در مرحله GV منجمد گردیده و پس از ذوب، مراحل لقاح و کشت در شرایط آزمایشگاهی را طی می نمایند
۲- تخمک های غیر منجمد
گروه آزمایشی پنجم: در این گروه بدون این که تخمک ها منجمد گردند، به محیط بلوغ آزمایشگاهی که دارای ng1000 آلدوسترون میباشد منتقل می شوند (و به مدت ۲۲ ساعت در این محیط باقی می ماند) و سپس مراحل لقاح و کشت در شرایط آزمایشگاهی را طی می کنند.
گروه آزمایشی ششم: در این گروه بدون این که تخمک ها منجمد گردند، پس از طی مرحله لقاح آزمایشگاهی، در روز چهارم کشت جنینی، ng1000 آلدوسترون به محیط کشت افزوده شده و به مدت ۲۲ ساعت در محیط باقی می مانند.
گروه آزمایشی هفتم: در این گروه تخمک ها بدون این که منجمد گردیده و یا آلدوسترونی دریافت نمایند، مراحل لقاح و کشت در شرایط آزمایشگاهی را طی می نمایند.
۳-۶-ارزیابی جنین‌ها
۳-۶-۱- ارزیابی کیفی جنین‌ها با بهره گرفتن از رنگ‌آمیزی افتراقی
رنگ آمیزی افتراقی توده سلولی داخلی^[۱۰۰] و سلول‌های تروفکتودرم^[۱۰۱]همراه با شناسایی تعداد سلول مرده، در مورد جنین‌هایی که به مرحله بلاستوسیست می‌رسند، انجام می‌شود. ابتدا بلاستوسیست‌های مورد نظر به منظور شمارش تعداد سلول های مرده، به مدت ۳-۲ دقیقه در یک قطره ۱۰۰ میکرولیتری حاوی ۳۰ µg/ml پروپیدیوم یداید^[۱۰۲] (PI) منتقل، سپس در محیط HSOF+BSA 5mg/ml چند بار شسته شده و در قطره‌ی کوچکی از همین محیط شستشو، شمارش سلول‌های مرده زیر میکروسکوپ مجهز به سیستم فلورسنت انجام می‌گیرد.
در ادامه جنین‌ها به مدت ۱۵ ثانیه در یک قطره ۱۰۰ میکرولیتری (HSOF + 5 mg/ml BSA) حاوی ۲/۰ درصد تریتون^[۱۰۳]قرار گرفته، سپس مستقیماً به قطره حاوی ۳۰ µg/mlپروپیدیوم یدید(PI) برای مدت زمان ۱ دقیقه منتقل و پس از آن چند بار در محیط HSOF+BSA 5mg/ml شسته می‌شوند. پس از این مرحله بلاستوسیست‌ها به داخل محیط اتانول حاوی ۱۰ میکروگرم هوخست^[۱۰۴]، به مدت ۱۵ دقیقه در مجاورت بسته یخ منتقل می شوند. در همین مدت زمان بر روی لام با واکس پارافین دو خط موازی با فاصله ۱ سانتی‌متر قرار داده و بین آن‌ها یک قطره‌ی کوچک گلیسرول گذاشته می‌شود.

بعد از اتمام ۱۵ دقیقه جنین ها از قطره رنگ‌آمیزی خارج و در قطره گلیسرول قرار داده شده و پس از استقرار لامل بر روی آن، جنین ها به منظور مشاهده تفریقی سلول‌های تروفکتودرم (به رنگ قرمز)و توده داخل سلولی(ICM) (به رنگ آبی)، در زیر میکروسکوپ مجهز به سیستم فلورسنت مورد بررسی قرار می‌گیرند.
- HSOF + 5 mg/ml BSA + 30 µg/ml PI (30 µl/ml PI stock)
- Ice cold ethanol + 10 µg/ml Hoechst
شکل۳-۱- رنگ آمیزی افتراقی بلاستوسیت های مشتق از تخمک های منجمد، در حضور آلدسترون در روز IVM و روز چهارم IVC (به ترتیب a و b)، و بدون حضور آلدسترون ©. هسته های توده سلولی داخلی بدلیل نشاندار کردن DNA با هوخست به رنگ آبی ظاهر شده است، در حالیکه سلولهای تروفکتودرم بدلیل رنگ آمیزی DNA هسته ای با پروپیدیوم یداید نفوذ ناپذیر غشایی، به رنگ صورتی ظاهر شده است.
۳-۷- ایمونوسایتوشیمی پروتئینهای سطحی جنین های گوسفندی (Sheep embryo ICC)

1. 1. ابتدا جنینها را از انکوباتور خارج گردیده و برای حذف محیط کشت از روی سلول ها، آنها را از دیشی که در محیط IVC قرار دارند، با پیپت پاستور استریل برداشته و با محلول PBS به آرامی جنینها شستشو داده شدند:

(ترجیحاً PBS+ 0.05% Tween-20+ 1mg/ml PVA)–(PVA: Soluble in cold water)

1. 1. بعد از شستشو برای فیکس نمودن جنینها با پارافرمالدهید ۴%، که می بایست در دمای ۳۷ درجه و به مدت ۱۰ دقیقه انجام پذیرد جنینها با پیپت پاستور برداشته شده و به محلول پارافرمالدهید ۴% انتقال داده شد.

1. 1. حذف محلول فوق (پارافرمالدهید ۴%) از روی نمونه ها و شستشوی جنین ها با محلول PBS، ۳-۲ مرتبه (بهتر است در اولین مرحله شستشو، جنین ها به مدت ۳ دقیقه در محلول شستشو باقی بمانند) انجام گرفت.

1. 1. افزودن Blocking Solution (10% Sheep Serum-PBS/ BSA 10mg/ml) و سپس انکوباسیون جنین ها به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق.

1. 1. حذف محلول بلوکه کننده از روی جنین ها (بدون این که پس از برداشت این محلول، شستشویی انجام پذیرد) و سپس افزودن آنتی بادی اولیه (Anti-Na⁺/K⁺/ATPase) در حلال آنتی بادی(آنتی بادی آماده) (۳% Sheep Serum-PBS/ BSA 10mg/ml) و انکوباسیون جنین ها در انکوباتور به مدت ۴ ساعت و سپس، به صورت Overnight در یخچال (۴ درجه) قرار گیرد.

1. 1. حذف محلول آنتی بادی اولیه از روی جنین ها و شستشوی سلول ها با محلول PBS، ۳-۲ مرتبه (بهتر است با محلول PBS، در سه مرحله، هر مرحله به مدت ۱۰ دقیقه شستشو شوند).

1. 1. حذف محلول شستشو و افزودن آنتی بادی ثانویه Sheep Anti Mouse FITC با غلظت (۲x)1:50 و انکوباسیون نمونه ها به مدت ۲ ساعت در انکوباتور (از این مرحله به بعد باید در فضای تاریک کار شود).

1. 1. حذف محلول آنتی بادی ثانویه از روی جنین ها و شستشو به روش گفته شده در مرحله ۶ .

1. 1. حذف محلول شستشو و افزودن µg/ml DAPI/PBS 0.2 به مدت ۳-۲ دقیقه در دمای اتاق (DAPI بهتر از PI می باشد) ( در برخی گروه ها DAPI استفاده نشد).

1. 1. شستشوی یک مرحله ای جنین ها در محلول PBS و سپس اضافه کردن یک قطره گلیسرول بر روی لام و چسباندن لامل بر روی لام.

طرز تهیه آنتی بادی اولیه( (Ab Primery : α، در هر میکروتیوپ lµ۲ آنتی بادی است که اگر به حجم lµ۴۰۰ برسد با حلال آنتی بادی، نسبت ۱:۱۰۰ حاصل میگردد.
β، در هر میکروتیوپ lµ۲ آنتی بادی است که اگر به حجم lµ۲۰۰ برسد با حلال آنتی بادی، نسبت ۱:۲۰۰ حاصل میگردد.
طرز تهیه آنتی بادی ثانویه(Ab Secondry): 1:50 با حلال آنتی بادی تهیه میشود.
در نهایت نسبتهای آنتی بادیها به این صورت Set up گردید:
α: Primery4x-Secondry4x
β: Primery2x-Secondry2x
شکل ۳-۲- رنگ آمیزی ایمونوسیتوشیمی زیر واحد های α_۱ و β_۱ پمپ Na⁺/K⁺ ATPase . زیر واحد های α_۱ و β_۱ با فضاهایی با رنگ سبز قابل تشخیص می باشد. بیان زیر واحد α_۱ در بلاستوسیت های مشتق از اووسیت در حضور و بدون حضور آلدسترون در زمان IVM ( به ترتیب a و b)، بیان زیر واحد β_۱ در بلاستوسیت های مشتق از اووسیت در حضور و بدون حضور آلدسترون در مدتIVM ( به ترتیب c و d)، بیان زیر واحد α_۱ در بلاستوسیت های مشتق از جنین در حضور و بدون حضور آلدسترون در روز چهارم IVC ( به ترتیب e و f )، بیان زیر واحد β_۱ در بلاستوسیت های مشتق از جنین در حضور و بدون حضور آلدسترون در روز چهارم IVC ( به ترتیب g و h ).
جدول ۳-۱- ترکیبات محیط HEPES buffered M199